[发明专利]用于检测细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的融合蛋白组、重组载体组、及检测方法

说明书

本发明公开了用于检测细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的融合蛋白组、重组载体组、及检测方法。该融合蛋白组包括融合蛋白YNF和融合蛋白YCS，所述融合蛋白YNF由荧光蛋白片段YN、连接肽和FXR组成，融合蛋白YCS由荧光蛋白片段YC、连接肽和SUMO1Δ组成。通过向细胞系中瞬时转染表达上述融合蛋白组的重组载体质粒组，本发明所述BiFC体系能通过可视化或酶标仪检测荧光信号，在活细胞状态下对细胞中FXR蛋白的SUMO化修饰进行表征，从而实现对FXR蛋白SUMO化修饰的方便快速的检测，同时也为FXR蛋白SUMO化修饰抑制的快速筛选提供了一种可行性方法。

技术领域

本发明属于生物技术，特别涉及用于检测细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的融合蛋白组、重组载体组、及检测方法。

背景技术

法尼醇x受体(FXR，NR1H4)是核受体超家族的一员，胆汁酸是其在生物体内的内源性配体。大量研究表明它在调节胆汁酸代谢，脂质代谢和糖代谢中发挥重要功能，同时它与能量平衡，炎症与免疫，肝纤维化以及肝脏再生密切相关。FXR发挥其生理功能的一个重要途径即是受配体激动，进入细胞核调控某些基因的转录活性，产生转录激活或转录抑制作用进而调控一系列信号通路。

FXR的生理学功能受多个蛋白质翻译后修饰的调控，研究表明小泛素样修饰因子(SUMO)能够对FXR进行翻译后修饰，其中SUMO1与FXR结合后会抑制FXR与靶基因启动子的结合，从而影响FXR的转录调控活性，使其对下游靶基因的激活作用下降。另有研究表明，在肝纤维化动物模型中，肝星状细胞(HSC)中FXR的SUMO化水平显著上升，单独给予FXR激动剂进行治疗无显著效果，当连用SUMO化抑制剂后，FXR激动剂治疗肝脏纤维化的效果显著。由此可见，快速有效的筛选鉴定FXR蛋白SUMO化抑制剂意义重大。

目前对于SUMO化抑制剂的筛选鉴定方法主要是在体外蛋白反应体系以及体内过表达SUMO蛋白，然后通过Westernblot进行鉴定，无法进行快速大量的筛选工作。

双分子荧光互补技术(BiFC)是一种能够快捷且直观判断两种目的蛋白相互作用的技术，其原理是将荧光蛋白分割成两段无荧光片段N-fragment和C-fragment分别与两个目的蛋白形成融合蛋白，当两个目的蛋白发生相互作用时，在空间位置上将两个荧光蛋白片段相互靠近，进而融合形成一个完整的荧光蛋白构象，此时在相应激发光的照射下则能够产生荧光。不发生相互作用的两个蛋白不会靠的很近，使得两个荧光蛋白片段在空间上相离，故不会融合在一起。目前已有报道可用于BiFC检测的荧光蛋白有YFP、Venus、Citrine等等，分割位点为氨基酸序列155或173处。另外，BiFC体系具有广泛的适用性，在哺乳动物细胞、植物细胞以及线虫中均能够较好的用于检测蛋白相互作用。相比于一些传统的检测蛋白质相互作用的技术，如免疫共沉淀技术(Co-IP)、GST融合蛋白pull-down技术、酵母双杂交系统(Y2H)等，BiFC体系能进行活细胞检测且检测方法简便快捷，适合用于开发高通量筛选体系。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种用于检测细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的融合蛋白组、重组载体组、DNA分子组。

本发明的另一目的是提供一种用BiFC体系检测影响细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的物质的方法。

技术方案：所述用于检测细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的融合蛋白组，由融合蛋白YNF和融合蛋白YCS组成；其中融合蛋白YNF由FXR和位于其N末端的荧光蛋白片段YN组成；融合蛋白YCS由SUMO1Δ和位于其N末端的荧光蛋白片段YC组成；上述SUMO1Δ是SUMO1蛋白的一个变异体，即在完整的SUMO1蛋白的C末端截去4个氨基酸得到1-97位氨基酸的活化蛋白分子SUMO1Δ。