[发明专利]一种高表达猪PBMCs细胞因子的饲养层细胞构建方法

说明书

一种高表达猪PBMCs细胞因子的饲养层细胞构建方法，包括以下步骤：(1)从猪的外周血单个核细胞中克隆细胞因子，设计同源臂引物并连接慢病毒载体，构建含有细胞因子的重组质粒；(2)使用转染的方式，利用阳离子转染试剂，将构建的重组质粒同辅助质粒共转染包装慢病毒的细胞；(3)用包装的慢病毒感染饲养层细胞。本发明将猪IL‑2、IL‑4和IFN‑α基因插入到猪PK‑15细胞基因组内，构建能稳定表达并分泌细胞因子的饲养层细胞，替代猪外周血单个核细胞培养的添加物。所构建的饲养层细胞适合大规模培养，同时也极大地降低了培养成本，操作技术简单，适用性广泛，可广泛用于猪外周血单个核系和猪特定免疫细胞的培养。

技术领域

本发明涉及构建表达细胞因子的饲养层细胞的方法，尤其是构建高表达猪PBMCs细胞因子的饲养层细胞的方法，属于生物领域。

技术背景

外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)是指血液中具有环形核的细胞总称。PBMCs包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。其中，淋巴细胞又包括T细胞、B细胞和NK细胞。在外周血免疫细胞生长发育和成熟过程中，除了需要抗原刺激之外，细胞因子在促进和调节免疫系统的功能方面发挥着不可替代的作用。例如，初始辅助性T细胞(Th0)分化时，不同细胞因子决定其不同的命运：在细胞因子IL-4作用下Th0能分化为Th1，在细胞因子IFN-γ作用下Th0能分化为Th2。Th1细胞的进一步分化需要许多其他的的细胞因子参与，包括IL-2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和IFN-γ等。而Th2细胞通过分泌IL-4和IL-6等促进B细胞的成熟。IFN-α和IFN-γ能促进自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)增殖和分化。这表明，在外周血免疫细胞分化、发育和成熟过程中，IL-2和IL-4处于细胞因子网络的中心。

目前国内外已经有成功应用饲养细胞的例子。例如经典的L929为小鼠成纤维细胞，由于其细胞培养上清中表达较高的小鼠巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colonystimulating factor，M-CSF)，因而常被用来纯化细胞因子M-CSF或直接用于诱导骨髓来源的巨噬细胞。L929细胞培养上清诱导骨髓来源的巨噬细胞，与商品化的M-CSF诱导骨髓来源的巨噬细胞具有几乎相同的效果，极大地降低了培养成本。

目前关于猪的细胞因子如IL-2、IL-4和IFN-α国外仅有少数生物公司生产，国内几乎没有相关商品化的细胞因子。并且，由于猪的细胞因子相对应用较少，其商品化受到了较大的限制，其价格也较为昂贵。因此，快速构建表达这些细胞因子的饲养层细胞，是利用这些冷门细胞因子进行猪外周血单个核细胞体外扩增培养的经济快捷的技术方法。

发明内容

本发明的目的是快速构建稳定高表达猪细胞因子IL-2、IL-4和IFN-α的饲养层细胞，特点是快速、低成本、操作简单，可用于猪PBMCs的培养。

为了实现该目的，本发明构建了表达IL-2、IL-4和IFN-α的表达载体，并且将该载体转染到细胞系内，利用抗性基因筛选稳定表达这些细胞因子的细胞系。具体步骤如下：

(1)从猪的外周血单个核细胞中克隆细胞因子，设计同源臂引物并连接慢病毒载体，构建含有细胞因子的重组质粒；

(2)使用转染的方式，利用阳离子转染试剂，将构建的重组质粒同辅助质粒共转染包装慢病毒的细胞；

(3)用包装的慢病毒感染饲养层细胞，

所述细胞因子为IL-2或IL-4或IFN-α。

优选地，所述同源臂引物的序列如下：

猪IL-2F同源臂引物：gaacacaggaccggttctagaATGTATAAGATGCAGCTCTTG