[发明专利]一种高表达猪PBMCs细胞因子的饲养层细胞构建方法在审
| 申请号： | 202111364146.0 | 申请日： | 2021-11-17 |
| 公开（公告）号： | CN114107395A | 公开（公告）日： | 2022-03-01 |
| 发明（设计）人： | 崔旻;王珂 | 申请（专利权）人： | 华中农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N5/10 |
| 代理公司： | 武汉智嘉联合知识产权代理事务所(普通合伙) 42231 | 代理人： | 徐绍新 |
| 地址： | 430070 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 表达 pbmcs 细胞因子 饲养 细胞 构建 方法 | ||
1.一种高表达猪PBMCs细胞因子的饲养层细胞构建方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)从猪的外周血单个核细胞中克隆细胞因子，设计同源臂引物并连接慢病毒载体，构建含有细胞因子的重组质粒；
(2)使用转染的方式，利用阳离子转染试剂，将构建的重组质粒同辅助质粒共转染包装慢病毒的细胞；
(3)用包装的慢病毒感染饲养层细胞，
所述细胞因子为IL-2或IL-4或IFN-α。
2.如权利要求1所述高表达猪PBMCs细胞因子的饲养层细胞构建方法，其特征在于，所述同源臂引物的序列如下：
猪IL-2F同源臂引物：gaacacaggaccggttctagaATGTATAAGATGCAGCTCTTG
猪IL-2R同源臂引物：gaagtttgttgcgccggatccTCAAGTCAGTGTTGAGTAGATG
猪IL-4F同源臂引物：gaacacaggaccggttctagaATGGGTCTCACCTCCCAACTG
猪IL-4R同源臂引物：gaagtttgttgcgccggatccTCAACACTTTGAGTATTTCTC
猪IFN-α4F同源臂引物：gaacacaggaccggttctagaATGGCCCCAACCTCAGCC
猪IFN-α4R同源臂引物：gaagtttgttgcgccggatccTCACTCCTTCTTCCTGAATC。
3.如权利要求1所述高表达猪PBMCs细胞因子的饲养层细胞构建方法，其特征在于：所述慢病毒载体为pHKO-EF1a，该质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
4.如权利要求1所述高表达猪PBMCs细胞因子的饲养层细胞构建方法，其特征在于：所述包装慢病毒的细胞为293T细胞。
5.如权利要求1所述高表达猪PBMCs细胞因子的饲养层细胞构建方法，其特征在于：所述辅助质粒为psPAX2和pMD2.G。
6.如权利要求5所述高表达猪PBMCs细胞因子的饲养层细胞构建方法，其特征在于：所述重组质粒与辅助质粒psPAX2、pMD2.G的用量分别为2μg、2μg、1μg。
7.如权利要求6所述高表达猪PBMCs细胞因子的饲养层细胞构建方法，其特征在于：所述重组质粒与辅助质粒的总量与阳离子转染试剂的比例为1：1～4(μg：μl)。
8.如权利要求1所述高表达猪PBMCs细胞因子的饲养层细胞构建方法，其特征在于：所述饲养层细胞为猪肾细胞PK-15。
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