[发明专利]一种检测药物西地那非和N-去甲基西地那非的方法

说明书

本发明公开了一种基于LC‑MS/MS技术检测药物西地那非和N‑去甲基西地那非的方法，取用100μL血浆样品进行简单的蛋白沉淀处理后测定西地那非和N‑去甲基西地那非浓度，该方法前处理简单、质谱采集时间短、成本低廉、方便实验室进行大规模临床样本检测。

技术领域

本发明属于药物浓度检测领域，具体涉及一种采用高效液相色谱串联质谱技术测定人血浆西地那非和N-去甲基西地那非的方法。

背景技术

枸橼酸西地那非是一种 5 型磷酸二酯酶（PDE5）抑制剂，PDE5 在阴茎海绵体中高度表达。当性刺激引起局部一氧化氮（NO）释放时，NO 激活鸟苷酸环化酶，导致环磷酸鸟苷（cGMP）水平增高，使海绵体平滑肌松弛，血液流入而使阴茎勃起。西地那非通过选择性抑制PDE5，升高环磷酸鸟苷（cGMP）水平而导致阴茎海绵体平滑肌松弛，从而对阴茎血流水平进行调控。枸橼酸西地那非临床上用于治疗勃起功能障碍（ED），能安全有效地改善各种 ED患者的勃起功能。

枸橼酸西地那非片的原研单位为辉瑞（Pfizer）制药有限公司，于 1998 年 3 月在美国批准上市，商品名为 VIAGRA®。1998 年 9 月在欧洲批准上市，1999 年在日本上市。2000 年进口 中国，2007 年原研地产化品种上市，商品名为万艾可®。

目前西地那非和N-去甲基西地那非治疗药物检测的常见方法有：紫外分光光度法、高效液相色谱法。这些方法存在前处理复杂、定性定量不够准确、成本高、分析时间长、或对实验人员技术要求高等问题。液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）越来越广泛应用于药物、食品、环境、法医、临床等各个领域。LC-MS/MS具有灵敏度高，选择性强，准确性好等特点，在临床检测上适用范围远远超过放射性免疫检测和化学检测范围，是其他方法无可比拟的。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种基于液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术检测人血浆中西地那非和N-去甲基西地那非药物的含量的检测方法，该方法前处理简单、质谱采集时间短、成本低廉、方便实验室进行大规模临床样本检测。

本发明所述的一种采用高效液相色谱串联质谱技术能分别定量检测血浆中西地那非和N-去甲基西地那非的方法，包括以下步骤：

（1）血浆样品预处理

在黄光冰浴条件下，移取 100 μL 样品至96 孔板中，加入 10 μL氘代内标工作溶液，加入390 μL 的0.5%氨水甲醇溶液，将样品涡旋5分钟后，在 4000 rpm、4°C条件下离心5分钟，用移液工作站移取上清液 150 μL 至 96 孔板中，使用 150 μL 含0.5%氨水[甲醇：水（1：3）]溶液稀释，涡旋5分钟，在 4000 rpm、4°C 条件下离心5分钟，得到待测样品。

（2）标准曲线和质控血浆样品的配制

使用甲醇配制标曲和质控工作溶液，取上述工作溶液10μL与490 μL空白生物基质混合配制成不同浓度的标准曲线样品和质控样品，用西地那非和N-去甲基西地那非和内标的峰面积比和标准样品的浓度来建立标准曲线，得到相应的线性回归方程。

（3）采用液相色谱-质谱联用检测

液相色谱条件：色谱柱：Titank C18 5u 50*2.1mm；

流动相：水相：5mmol/L乙酸铵溶液，有机相：乙腈，洗针液：甲醇：乙腈：异丙醇：水：甲酸（1:1:1:1:0.0004）溶液；

柱温：35℃；自动进样器温度：4℃；

采用水相和有机相为混合流动相进行梯度洗脱，每个样品采集时间为4 min，进样体积为2 mL，流速为0.5 mL/min，流动相梯度洗脱参数如下：0 min，20%有机相；2.5 min，90%有机相；3.4 min，90 %有机相；3.5 min，20%有机相；4 min，停止。