[发明专利]一种检测药物西地那非和N-去甲基西地那非的方法

权利要求书

1.一种检测药物西地那非和N-去甲基西地那非的方法，其特征在于，采用基于LC-MS/MS技术检测，具体步骤包括样品预处理、样品配制、液相色谱-质谱检测和待测样品的测定；

所述样品预处理具体步骤为：

在黄光冰浴条件下，移取 100 μL 样品至96 孔板中，加入 10 μL氘代内标工作溶液，加入390 μL 的0.5%氨水甲醇溶液，将样品涡旋5分钟后，在 4000 rpm、4°C条件下离心5分钟，用移液工作站移取上清液 150 μL 至 96 孔板中，使用 150 μL 含0.5%氨水[甲醇：水（1：3）]溶液稀释，涡旋5分钟，在 4000 rpm、4°C 条件下离心5分钟，得到待测样品。

2.根据权利要求1所述的检测药物西地那非和N-去甲基西地那非的方法，其特征在于，所述样品配制包括标准曲线和质控血浆样品的配制：使用甲醇配制西地那非和N-去甲基西地那非标曲和质控工作溶液，取上述工作溶液10μL与490 μL空白生物基质基质混合配制成不同浓度的标准曲线样品和质控样品，用西地那非和N-去甲基西地那非和内标的峰面积比和标准样品的浓度来建立标准曲线，得到相应的线性回归方程。

3.根据权利要求1所述的检测药物西地那非和N-去甲基西地那非的方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱检测的检测条件如下：

液相色谱条件：色谱柱：Titank C18 5u 50*2.1mm；

流动相：水相：5mmol/L乙酸铵溶液，有机相：乙腈，洗针液：甲醇：乙腈：异丙醇：水：甲酸（1:1:1:1:0.0004）溶液；

柱温：35℃；自动进样器温度：4℃；

采用水相和有机相为混合流动相进行梯度洗脱，每个样品采集时间为4 min，进样体积为2 mL，流速为0.5 mL/min，流动相梯度洗脱参数如下：0 min，20%有机相；2.5 min，90%有机相；3.4 min，90 %有机相；3.5 min，20%有机相；4 min，停止；

质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用选择反应监测模式，正离子化方式，离子化电压 (ION)： 3500V，鞘气 (Sheath Gas)：60 Arb，辅助气 (Aux Gas)：15Arb，尾吹气(Sweep Gas)：2Arb，离子传输管温度 (Ion Transfer Tube Temp)：380℃，蒸发器温度(Vaporizer Temp)：350℃，循环时间 (Cycle Time)：0.4sec，离子对分别为：m/z 475.3→283.19 (Sildenafil)，碰撞能量（CE）和射频电压（RF）分别为39 V和119 V，m/z 483.37→283.19 (Sildenafil-d8)， 碰撞能量（CE）和射频电压（RF）分别为39V和116 V，m/z 461.3→283.17 (N-Desmethyl Sildenafil)，碰撞能量（CE）和射频电压（RF）分别为38V和108 V，m/z 469.34→283.18 (N-Desmethyl Sildenafil-d₈)，碰撞能量（CE）和射频电压（RF）分别为40V和105 V。

4.根据权利要求1所述的检测药物西地那非和N-去甲基西地那非的方法，其特征在于，所述待测样品的测定步骤如下：将待测血浆按照样品制备的方法制备，取待测样品采用液相色谱-质谱联用检测的方法检测，将测得的西地那非和N-去甲基西地那非和内标的峰面积比值代入所建的标准曲线中，计算得到待测血浆中西地那非和N-去甲基西地那非的浓度。