[发明专利]一种同时检测TSWV、TZSV、PCSV、INSV四种病毒的多重RT-PCR方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种同时检测TSWV、TZSV、PCSV、INSV四种病毒的多重RT‑PCR方法及试剂盒，所涉方法及试剂盒均包含四组引物：PCSV‑muF/PCSV‑muR、INSV‑muF/INSV‑muR、TSWV‑muF/TSWV‑muR、TZSV‑muF/TZSV‑muR。本发明的有益效果为，本发明所涉及的引物特异性强，灵敏度高，在实际多重RT‑PCR检测过程中十分高效，可以同时检测番茄斑萎病毒(TSWV)、番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)、凤仙花坏死斑点病毒(Impatiens necrotic spot virus,INSV)和辣椒褪绿斑点病毒(Pepper chlorotic spot virus,PCSV)。

技术领域

本发明涉分子植物病毒学病毒检测技术领域，具体涉及一种同时检测烟草中四种番茄斑萎病毒属病毒的RT-PCR引物组及其检测方法。

背景技术

由蓟马传播的番茄斑萎病毒属病毒(Tospoviruses)引起的烟草斑萎病，是近年来出现的烟草新病害。2007年以前，该病害在云南省零星发生，之后逐年加重，至2010前后开始在云南昆明、红河、文山烟区暴发流行，发病率通常在10-30％，严重的烟区发病率在90％以上，给当地烟叶生产造成巨大损失，部分重病烟田绝收。近年来，随着西花蓟马在全国范围内的扩散和气候变暖等因素，烟草斑萎病逐渐在其他烟区发生和流行，目前除云南外，还在四川、广西、甘肃、山东、黑龙江等烟叶产区发生。

根据近年的调查结果，团棵期以前的烤烟最易感染烟草斑萎病，显症高峰期主要集中在团课末期和旺长初期，在采烤期也能观察到斑萎病，但发病率低。烟草生长早期被感染后，叶片上形成坏死斑或者坏死同心圆环，部分叶片一半坏死，生长点坏死，形成歪头症状，严重者整株死亡，给烟叶生产造成巨大损失。

目前世界上已报道了20余种Tospovirues，通过机械接种和实验条件下的蓟马传毒均能侵染烟草，目前在我国检测到的烟草斑萎病病原主要有4种番茄斑萎病毒属病毒，即番茄斑萎病毒(TSWV)、番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)、凤仙花坏死斑点病毒(Impatiens necrotic spot virus,INSV)和辣椒褪绿斑点病毒(Pepperchlorotic spot virus,PCSV)。

目前尚没有烟草斑萎病抗病品种，生产上烟草斑萎病防控重在防控蓟马，辅以烟株诱抗等技术提高植株抗性。上述四种番茄斑萎病毒属病毒在烟草上产生的症状基本一致，肉眼无法分辨，只能通过分子检测手段加以确定。RT-PCR具有灵敏度高、特异性强、检测效率高、成本低廉等优点，是目前植物病毒检测应用最为广泛的检测方法。上述四种病毒的单重RT-PCR检测手段已经较为成熟，但是针对上述四种病毒的多重PCR检测方法国内外还没有报道。

发明内容

本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种同时检测TSWV、TZSV、PCSV、INSV四种病毒的多重RT-PCR方法及试剂盒。

本发明采用如下技术方案实现。

一种同时检测TSWV、TZSV、PCSV、INSV四种病毒的多重RT-PCR方法，本发明所述的方法包括以下四组引物：

PCSV-muF：5'-GTTCGTTTTCTGCGGTAAGCAAA-3'；

PCSV-muR：5-AGCAACATCATAATTGGGAGG-3'；

INSV-muF：5-GAACATGACTACTGCATCTTG-3'；

INSV-muR：5-TAGACATGTCAATTCCAAGC-3'；

TSWV-muF：5-GATGAGTGTTATTTCATGTCTGAC-3'；

TSWV-muR：5-CAAGCTATCAAGCCTTCTGAAG-3'；