[发明专利]一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物及方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物及方法和试剂盒。包括至少两组引物，每组引物包括一对外引物和一对内引物。具体引物如SEQ ID NO.1～16所示。本申请能够同时针对四种利什曼原虫特异DNA片段开展利什曼原虫高通量检测，灵敏度为100％，特异性为99.42％，准确性可达99.55％，可以缩短检测时间，提高检测效率。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物及方法和试剂盒。

背景技术

利什曼原虫病(Leishmaniasis)被世界卫生组织界纳入五大寄生虫病之列，由利什曼原虫(Leishmania spp)引起，致病性复杂，广泛分布于亚、欧、非、拉丁美洲等地。全世界每年有150万—200万人感染利什曼原虫病，大约80多个国家报告过利什曼原虫病，对3.5亿健康人群产生威胁。我国利什曼原虫病的发病率较低，维持在0.0372/10万的水平，主要是散发病例。国内对利什曼原虫快速检测方面开展的研究工作较少，缺乏快速检测的PCR商品化试剂。我国境外技术和劳务人员工作主要目的地，利什曼原虫病疫情不断出现，我国在多个入境口岸监测到疑似感染利什曼原虫的归国劳务人员。国内外疫情状况的差别，使得境外劳务人员感染利什曼原虫病后，入境时面临没有利什曼原虫检测试剂的局面，对病例后期诊断、救治等工作造成了很大困难。因此建立利什曼原虫高通量检测技术，第一时间确定感染利什曼原虫种类，是提高口岸防控利什曼原虫病效率的根本保证。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物及方法和试剂盒，本申请能够同时针对四种利什曼原虫特异DNA片段开展利什曼原虫高通量检测，可以缩短检测时间，提高检测效率。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物，包括至少两组引物，每组引物包括一对外引物和一对内引物。

进一步地，引物包括至少四组引物，每组引物包括一对外引物和一对内引物。

进一步地，引物如SEQ ID NO.1～16所示。

进一步地，利士曼原虫为杜氏利士曼原虫、婴儿利士曼原虫、热带利士曼原虫和硕大利士曼原虫。

一种基于多重串联式PCR基因碟片检测利士曼原虫的方法，包括以下步骤：

(1)提取待检样品DNA；

(2)采用上述引物中的内引物制备基因碟片，备用；

(3)采用上述引物中的外引物进行第一轮PCR扩增，然后再以第一轮扩增产物为模板，采用基因碟片进行第二轮PCR扩增即可。

进一步地，待检样品为含有杜氏利士曼原虫、婴儿利士曼原虫、热带利士曼原虫和硕大利士曼原虫中至少一种基因的质粒标准品。

进一步地，基因碟片的制备过程为：

取11μL内引物，将其加入到扩增反应板中，调整浓度，使最终浓度达到0.4μmol/L。然后将扩增反应板放置于-50℃的条件下干燥处理20min，再使用封口膜封闭扩增反应板，最后将扩增反应板放置于4℃的条件下备用。

进一步地，第一轮PCR扩增反应体系包括：0.3μL Mix1、20ng核酸模板、0.2μmol/L外引物混合物，25μL Mix2，最后用ddH₂O补足至50μL；

扩增程如下：95℃预变性10min；94℃变性30s；58℃退火60s；72℃延伸60s，共20个循环；最后72℃延伸1min。