[发明专利]一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物及方法和试剂盒

权利要求书

1.一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物，其特征在于，包括至少两组引物，每组引物包括一对外引物和一对内引物。

2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物包括至少四组引物，每组引物包括一对外引物和一对内引物。

3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于，所述引物如SEQ ID NO.1～16所示。

4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，所述利士曼原虫为杜氏利士曼原虫、婴儿利士曼原虫、热带利士曼原虫和硕大利士曼原虫。

5.一种基于多重串联式PCR基因碟片检测利士曼原虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待检样品DNA；

(2)采用权利要求1～3任一项所述引物中的内引物制备基因碟片；

(3)采用权利要求1～3任一项所述引物中的外引物进行第一轮PCR扩增，然后再以第一轮扩增产物为模板，采用基因碟片进行第二轮PCR扩增即可。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待检样品为含有杜氏利士曼原虫、婴儿利士曼原虫、热带利士曼原虫和硕大利士曼原虫中至少一种基因的质粒标准品。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因碟片的制备方法为：

将各内引物，分别成对加入到扩增反应板中，然后用ddH₂O调整浓度为0.4μmol/L，再置于-50℃的条件下干燥处理20min，封闭扩增反应板，最后将扩增反应板放置于4℃条件下即可。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增反应体系包括：0.3μLMix1、20ng核酸模板、0.2μmol/l外引物混合物，25μL Mix2，最后用ddH₂O补足至50μL；

扩增程如下：95℃预变性10min；94℃变性30s；58℃退火60s；72℃延伸60s，共20个循环；最后72℃延伸1min。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述采用基因碟片开展第二轮PCR扩增反应体系操作方法：SYBR Premix Ex Taq的SYBR扩增试剂56μL、第一轮PCR产物稀释物4.5μL、ddH₂O 52μL，均匀混合后，向基因碟片的扩增反应板中加入混合物，每孔25μL；

扩增程序如下：95℃预变性10min；94℃变性10s，54℃退火10s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸1min。

10.一种用于检测利士曼原虫的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的引物。