[发明专利]一种从红刀豆中提取脲酶的方法

说明书

本发明属于生物蛋白提取技术领域，具体涉及一种从红刀豆中提取脲酶的方法，方法包括如下步骤：称取红刀豆研磨成粉，筛分后加入提取液，将红刀豆粉末和提取液充分搅拌，在室温下离心，收集上清液A，上清液A滤纸抽滤，得到上清液B；在上清液B加入60％PEG4000，在4℃温度下静置，离心，收集沉淀；将沉淀加入重悬液，重悬溶解后离心，收集上清并抽滤，得到溶液A；先用HCl将溶液A调为pH＝5.1，再用NaOH将溶液调为pH＝6.0，得到溶液B；将溶液B加入至柠檬酸‑柠檬酸钠中进行透析，在4℃温度下静置，离心，抽滤，收集上清，冻干。本发明制备流程简单，不需要在提取剂中添加丙酮溶液，反应温和，最终可得到蛋白浓度较高的脲酶。

技术领域

本发明属于生物蛋白提取技术领域，具体涉及一种从红刀豆中提取脲酶的方法。

背景技术

脲酶是一种十分重要的生物制剂，广泛分布于植物的种子中，以大豆和刀豆中的含量最高。脲酶是一种寡聚酶，可以催化尿素水解释放氨和二氧化碳，催化效率比无脲酶存在下的速率高出1000多倍，脲酶被广泛的应用于农业，医药行业等领域：在韩国，它被用于治疗呕吐、腹部浮肿、肾脏相关腰痛，在日本，它对治疗脓溢、中耳炎、疖子和癌症、各种炎症性疾病和特应性皮炎有效，在中国，脲酶被用于处理动物排泄物，防止空气污染，同时脲酶还可以处理含有尿素的废水，符合了中国当今绿色化学的要求。随着我国经济发展，固定化脲酶技术的进步，对脲酶的需求越来越大。

我国的豆类资源十分丰富，而目前国内针对脲酶提取的研究报告主要集中在大豆，黄豆等植物中提取和纯化，崔有宏等人在“黄豆脲酶的提取与性质研究”一文中采用醋酸盐缓冲液对黄豆粉进行提取，然后通过亚硫酸钠盐析，其沉淀再经磷酸盐缓冲液溶解，透析，DEAE-纤维素柱色谱分离，洗脱液冷冻干燥后得到脲酶产品。但是该工艺流程复杂，脲酶损失严重，成本较高。Hsien-Yi Sung等人在“A Procedure for Purifying Jack BeanUrease for Clinical Use”中提到了一种纯化尿素酶的方法，采用20％丙酮(含1mM EDTA和1mM巯基乙醇)进行提取，离心，清液调节丙酮浓度至31-35％，然后再经氢氧化钠碱化，再40℃热处理5min，离心，清液用柠檬酸调节至等电点附近，离心收集沉淀，再用磷酸盐缓冲液中和后冷冻干燥即可得脲酶。该方法虽然可以得到纯度较高的蛋白，但是使用了丙酮危险试剂，且实验过程危险。

红刀豆脲酶对比洋豆类脲酶丙酮提取来说，其原材料红刀豆易获得，红刀豆主要分布在中国的南部且产量十分丰富，且实验过程不需要丙酮危险试剂，对比大豆，黄豆脲酶提取来说，提取红刀豆脲酶的优势在于过程路线简单，提取的脲酶纯度较高。目前以红刀豆为原料的提取技术研究较少，使用该种方法提取脲酶，原料、提取试剂易获得，提取的脲酶纯度高，具有工业化生产的前景。

发明内容

本发明的目的在于克服传统技术中存在的上述问题，提供一种从红刀豆中提取脲酶的方法，该方法工艺流程简单，操作时间短，条件温和，无需使用危险试剂，得到的脲酶纯度超过80％，活性好且回收率高，具有稳定的工业前景。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：

一种从红刀豆中提取脲酶的方法，包括如下步骤：

1)提取：称取红刀豆研磨成粉，筛分后加入提取液，28℃下将红刀豆粉末和提取液充分搅拌，使得红刀豆粉末中脲酶全部浸提，然后将浸提液在室温下离心，收集上清液A，上清液A滤纸抽滤，得到上清液B；

2)粗沉淀：在得到的上清液B加入60％PEG4000，在4℃温度下静置，离心，收集沉淀；

3)重悬：将得到的沉淀加入重悬液，重悬溶解后离心，收集上清并抽滤，得到溶液A；

4)调整pH值：先用HCl将得到的溶液A调为pH＝5.1，离心，收集上清，再用NaOH将溶液调为pH＝6.0，得到溶液B；