[发明专利]一种乳牙牙髓干细胞冻存液及其制备冻存方法及应用

说明书

本发明提供了一种乳牙牙髓干细胞冻存液、制备、冻存方法及应用，涉及干细胞冻存技术领域，能够在保证细胞的存活率、贴壁率、增殖率的前提下，提高基因的表达水平；该冻存液各成分组成为：甘油：10%‑30%；甘氨酸：0‑10mg/mL；甘露醇：1‑5mg/mL；PEG：1‑3mg/mL；精氨酸：5‑10mg/mL；人血清白蛋白：1‑5mg/mL；蔗糖浓储液：0%‑30%；肝素钠：1‑15mg/mL；SDS：0.1‑1mg/mL；吐温20：0%‑0.5%；其余为DMEM。本发明提供的技术方案适用于乳牙牙髓干细胞冻存的过程中。

技术领域

本发明涉及干细胞冻存技术领域，尤其涉及一种乳牙牙髓干细胞冻存液及其制备冻存方法及应用。

背景技术

近几年，干细胞库建立的需要以及临床上对干细胞的需求增加，对干细胞冻存与复苏方面的研究引起了越来越多的关注。SHED(乳牙牙髓干细胞)被确定为高增殖性克隆细胞群，能够分化成多种细胞类型，包括神经细胞、脂肪细胞和卵母细胞。其增殖率高,可向多种组织分化，且其易获得、无伦理争议，也不存在免疫排斥反应。随着越来越多的乳牙干细胞库的出现，乳牙牙髓干细胞将为组织工程和医学提供更广阔的应用前景。

细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有可能伴随造成生物性损伤。

细胞冻存液是一种细胞冻存时使用的溶液，它可以供给细胞生命代谢所必须的营养物质，同时可以防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤作用。冻存液中一般含有渗透型的保护液如甘油或10％的二甲基亚砜(DMSO)和10％-90％胎牛血清(FBS)。DMSO是一种重要的渗透型细胞保护剂。在超低温保存细胞时使用DMSO冷冻保护剂，可以有效地防止细胞内液生成冰晶、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤。DMSO能够快速穿透细胞膜从而进入细胞内部，通过降低胞内水的冰点来延缓细胞的冻存过程。同时也能通过提高细胞内离子浓度，来降低细胞内冰晶的形成数量，从而减少细胞损伤。

但是传统的细胞冻存液也有许多缺点。DMSO对细胞有一定毒性作用，浓度过高会引起较高的渗透压，不利于细胞复苏。FBS属于异源性物质，成分复杂，并存在引入污染和过敏原的风险，产生免疫原性反应，严重影响实验。且不同品牌、不同批次的血清也存在差异，会为重复实验带来影响。

因此，有必要研究一种无血清的乳牙牙髓干细胞冻存液及其制备冻存方法及应用来应对现有技术的不足，以解决或减轻上述一个或多个问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种乳牙牙髓干细胞冻存液、制备、冻存方法及应用，能够在保证细胞的存活率、贴壁率、增殖率的前提下，提高基因的表达水平。

一方面，本发明提供一种乳牙牙髓干细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液各成分组成为：甘油：10％-30％；甘氨酸：0-10mg/mL；甘露醇：1-5mg/mL；PEG：1-3mg/mL；精氨酸：5-10mg/mL；人血清白蛋白：1-5mg/mL；蔗糖浓储液：0％-30％；肝素钠：1-15mg/mL；SDS：0.1-1mg/mL；吐温20：0％-0.5％；其余为DMEM。％表示体积比，通常针对液态组分；mg/mL为单位体积内所含对应物质的质量，通常针对固态组分。

乳牙牙髓干细胞冻存液，所述冻存液各成分组成优选为：甘油：10％；甘氨酸：1mg/mL；甘露醇：1mg/mL；PEG：1mg/mL；精氨酸：5mg/mL；人血清白蛋白：1mg/mL；蔗糖浓储液：10％；肝素钠：10mg/mL；SDS：0.1mg/mL；吐温20：0.1％；其余为DMEM。