[发明专利]一种检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物及GICA-RT-LAMP试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物及GICA‑RT‑LAMP试剂盒，涉及剪秋萝斑驳病毒检测技术领域。本发明提供的检测引物组合物可以进行RT‑LAMP扩增，F3、B3、FIP、BIP、LF和LB共6条特异性引物识别LycMoV CP靶基因的8个序列，特异性强，准确性高。本发明提供的剪秋萝斑驳病毒的检测卡可以实现剪秋萝斑驳病毒的快速筛查。而将二者联合的GICA‑RT‑LAMP试剂盒具有操作简单、检测准确度高、适用性好的优势。

技术领域

本发明涉及剪秋萝斑驳病毒检测技术领域，具体而言，涉及一种检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物及GICA-RT-LAMP试剂盒。

背景技术

当归(Angelica sinensis(Oliv.)Diels)，是一种大宗名贵中药材，随着种植规模和地域的不断扩大，病毒病害频发。2020年，中国科学院西北生态环境资源研究院植物病害研究组对疑似病毒病感染的当归植株进行了RNA测序(Small RNA sequencing，sRNA-seq)，首次鉴定到了剪秋萝斑驳病毒(Lychnis mottle virus，LycMoV)。

LycMoV病毒属于伴生豇豆病毒科(Secoviridae)，可以通过机械传播，能够侵染荔枝，百合，牡丹，苜蓿等植物。LycMoV病毒具有两条RNA链，RNA1和RNA2各包含一个阅读开放框，RNA1编码蛋白酶辅助因子、RNA解旋酶、病毒基因组5’端结合蛋白、蛋白酶和聚合酶，RNA2编码运动蛋白、大外壳蛋白(coat protein,CP)和小外壳蛋白。

LycMoV病毒的检测体系尚不完善，目前的检测方法主要有高通量测序(High-throughput sequencing)或下一代测序(Next-generation sequencing,NGS)技术，以及逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，但上述方法程序复杂，检测费用高、对仪器设备和检测条件要求高，需要长期经验积累和具有专业操作技能的人员才能完成，因此使用范围受到很大的局限，无法满足当归种植现场及田间快速检测的需求。对于以种子繁殖的当归作物，种子质量是产业发展的关键，种子病毒含量低，RNA提取难度大，依赖于核酸提取的NGS或RT-PCR及其衍生技术检测的准确性受到影响，急需开发出适用于种子病毒病害快速、灵敏检测的新技术或新方法。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物及GICA-RT-LAMP试剂盒以解决上述技术问题。

本发明将胶体金免疫层析检测GICA与LAMP技术有机结合，先通过胶体金免疫层析GICA技术富集待测样本中的病毒粒子，通过检测线的条带显色快速筛查并判断样本中的病毒感染情况；而利用富集到的病毒粒子作为模板，进行反转录RT和DNA环介导等温LAMP扩增，扩增产物经肉眼观察，即可精确判断样本中的病毒感染情况。由此成功建立了GICA-RT-LAMP技术特异性检测剪秋萝斑驳病毒(LycMoV)的方法。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物，引物组合物包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB；正向外引物F3的序列如SEQ ID NO.1所示，反向外引物B3的序列如SEQ ID NO.2所示，正向内引物FIP的序列如SEQ ID NO.3所示，反向内引物BIP的序列如SEQ ID NO.4所示，正向环引物LF的序列如SEQ ID NO.5所示，反向环引物LB的序列如SEQ ID NO.6所示。

上述引物组合物为发明人经过大量实验筛选出的具有高检测准确度和特异性的引物组合，采用该引物组合物可以进行RT-LAMP扩增，F3、B3、FIP、BIP、LF和LB共6条特异性引物识别LycMoV CP靶基因的8个序列，特异性强，准确性高。