[发明专利]一种检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物及GICA-RT-LAMP试剂盒

权利要求书

1.一种检测侵染当归的剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，其包括剪秋萝斑驳病毒的检测卡和检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物，所述引物组合物包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB；所述正向外引物F3的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向外引物B3的序列如SEQ ID NO.2所示，所述正向内引物FIP的序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向内引物BIP的序列如SEQ IDNO.4所示，所述正向环引物LF的序列如SEQ ID NO.5所示，所述反向环引物LB的序列如SEQID NO.6所示；所述引物组合物针对的靶标基因如SEQ ID NO.7所示；

所述检测卡包括在衬板上依次设置的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述胶体金结合垫上含有胶体金剪秋萝斑驳病毒抗体的结合物，所述硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设置有检测T线和质控C线，所述检测T线包被有LycMoV的抗体IgG，所述质控C线包被有抗LycMoV抗体的二抗；所述检测T线上LycMoV的抗体IgG的包被量为每2mm线宽上包被1.0～1.5μg蛋白；所述抗LycMoV抗体的二抗的包被量为每2mm线宽上包被1.0～1.5μg蛋白；

所述胶体金结合垫上的剪秋萝斑驳病毒抗体的包被量为每1mL胶体金中含14-16μg的剪秋萝斑驳病毒抗体。

2.根据权利要求1所述的检测侵染当归的剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述检测卡还包括由下壳体和上壳体组成的卡槽，所述卡槽具有放置所述衬板的安装腔，所述衬板与所述下壳体的内壁固定连接，所述上壳体上间隔设置有加样窗和反应观察窗，所述加样窗空间上位于所述样品垫的上方，所述反应观察窗空间上位于所述硝酸纤维素膜的上方；所述上壳体与所述下壳体通过卡扣结构卡接。

3.根据权利要求1所述的检测侵染当归的剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RT-LAMP扩增反应试剂，所述RT-LAMP扩增反应试剂包括反转录酶、RNase抑制剂、dNTP混合物、反应缓冲液、MgSO₄和DNA 聚合酶。

4.根据权利要求3所述的检测侵染当归的剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述反转录酶选自AMV反转录酶或M-MLV反转录酶，所述反应缓冲液选自ThermoPol反应缓冲液。

5.根据权利要求3所述的检测侵染当归的剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括磷酸缓冲液、磷酸洗涤缓冲液、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品。

6.根据权利要求5所述的检测侵染当归的剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为水，所述阳性对照品为当归剪秋萝斑驳病毒外壳蛋白CP基因片段标准品。

7.根据权利要求3所述的检测侵染当归的剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述DNA 聚合酶选自Bst DNA 聚合酶。

8.一种采用如权利要求1-7任一项所述的试剂盒检测侵染当归的剪秋萝斑驳病毒的方法，其特征在于，包括：

（1）取待测溶液上样至剪秋萝斑驳病毒的检测卡的样品垫上，观察检测T线和质控C线的颜色变化，初次判断待测样品中是否含有剪秋萝斑驳病毒；

（2）若根据步骤（1）无法鉴别待测样品中是否含有剪秋萝斑驳病毒，进行反转录RT-LAMP扩增：将步骤（1）免疫富集反应后检测卡上的检测T线取下，以取下的检测T线作为模板，利用RT-LAMP检测引物组合物进行RT-LAMP扩增；根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品中是否含有剪秋萝斑驳病毒。