[发明专利]双生病毒DNA1分子诱导可遗传的烟粉虱基因沉默方法

说明书

本发明涉及双生病毒DNA1分子诱导可遗传的烟粉虱基因沉默方法，包括以下步骤：（1）2mDNA1沉默表达载体构建，包括获取烟粉虱基因靶标片段BtbioB的PCR纯化产物，所述纯化产物、载体分别进行双酶切，获得连接产物，获得重组沉默表达载体；提取烟草曲茎病毒TbCSV质粒；（2）获得携带2mDNA1‑bioB沉默表达载体的F₀代烟粉虱，采用显微注射法或人工饲喂法任一种接种烟粉虱，获得携带2mDNA1‑bioB沉默表达载体的F₀代烟粉虱；（3）田间释放F₀代烟粉虱，将2mDNA1介导的烟粉虱基因沉默效果可以遗传给下一代，为烟粉虱基因功能研究和烟粉虱防治提供有效途径。

技术领域

本发明涉及农业昆虫与害虫防治，具体涉及双生病毒DNA1分子诱导可遗传的烟粉虱基因沉默方法，即将双生病毒TbCSV改造的沉默载体诱导的烟粉虱基因沉默效果遗传给下一代的方法。

背景技术

设施蔬菜栽培产业不断发展，在为人类带来丰富的蔬菜产品的同时，其特殊的栽培环境也加重了病虫害的发生与为害，长期的化学防治已引起了害虫的抗药性、农药残留等问题，抗药性治理与非化学防控措施越来越受到重视，但是农业生产中依靠农药的现状并未完全改变。烟粉虱的田间防治中，化学农药的大量使用，使烟粉虱的抗药性也越来越强，为了避免进入农药使用量增加和抗药性增强的恶性循坏，分子生物学技术在病虫害防治的作用逐渐得到重视。

RNA干扰(RNAi)已被作为一种防控害虫的方法，病毒诱导基因沉默(Virusinduced gene silencing, VIGS)是可应用于田间的一种简单而有效的RNAi方法。2mDNA1沉默表达载体是双生病毒TbCSV的DNA1组分， 2mDNA1载体介导的基因沉默效果能否通过烟粉虱的卵遗传给下一代，放大基因沉默效果还未可知，避开通过基因编辑的技术难点获得害虫下一代基因沉默表型，并有效应用于田间防治的应用方法尚不清楚。

发明内容

为了弥补上述现有技术的不足，本发明的目的是提出双生病毒DNA1分子诱导可遗传的烟粉虱基因沉默方法，将2mDNA1载体通过显微注射、人工饲料的方式接种至烟粉虱体内，将2mDNA1介导的烟粉虱基因沉默效果可以遗传给下一代，为烟粉虱基因功能研究和烟粉虱防治提供有效途径。

本方案是通过以下技术方案实现的，双生病毒DNA1分子诱导可遗传的烟粉虱基因沉默方法，其技术要求是：包括以下步骤：

（1）2mDNA1沉默表达载体构建

① 获取烟粉虱基因靶标片段Bt bioB的PCR纯化产物

② 所述靶标片段 bioB的PCR纯化产物、2mDNA1载体分别进行双酶切，获得含有BamHI和XbaI两个粘性末端的靶标基因 bioB片段、2mDNA1载体片段；

③ 所述含有BamHI和XbaI两个粘性末端的靶标基因 bioB片段与2mDNA1载体片段连接，获得2mDNA1- bioB连接产物；

④ 所述2mDNA1- bioB连接产物热击转化克隆菌株大肠杆菌DH5α；热击处理后进行2mDNA1特异性检测，获得2mDNA1- bioB重组沉默表达载体；

⑤提取烟草曲茎病毒TbCSV质粒；