[发明专利]双生病毒DNA1分子诱导可遗传的烟粉虱基因沉默方法

权利要求书

1. 双生病毒DNA1分子诱导可遗传的烟粉虱基因沉默方法，其特征是：包括以下步骤：

（1）2mDNA1-bioB沉默表达载体构建

① 获取烟粉虱基因靶标片段bioB的PCR纯化产物

② 所述靶标片段bioB的PCR纯化产物、2mDNA1载体分别进行双酶切，获得含有BamHI和XbaI两个粘性末端的靶标基因bioB PCR纯化产物片段、2mDNA1载体片段；

③ 所述含有BamHI和XbaI两个粘性末端的靶标基因bioB PCR纯化产物片段与2mDNA1载体片段连接，获得2mDNA1-bioB连接产物；

④ 所述2mDNA1-bioB连接产物热击转化克隆菌株大肠杆菌DH5α；热击处理后进行2mDNA1特异性检测，获得2mDNA1-bioB重组沉默表达载体；

⑤提取烟草曲茎病毒TbCSV质粒和2mDNA1-bioB重组沉默表达载体；

（2）获得携带2mDNA1-bioB沉默表达载体的F₀代烟粉虱

采用显微注射法或人工饲喂法任一种接种烟粉虱；

①显微注射法具体为：

将2mDNA1-bioB沉默表达载体、TbCSV的质粒分别用注射缓冲液稀释到100 ng/μL；二者按照体积比2mDNA1-bioB：TbCSV=1：1混合，获得2mDNA1-bioB沉默表达载体接种液；取羽化1d的烟粉虱进行显微注射，注射2mDNA1-bioB沉默表达载体接种液，所述烟粉虱的雌雄比例为1:1，雌虫注射量为100头/μL，雄虫注射量为200头/μL，获得携带2mDNA1-bioB沉默表达载体的F₀代烟粉虱；

②人工饲喂法具体为：采用2mDNA1-bioB人工饲料饲喂烟粉虱；

所述2mDNA1-bioB人工饲料的配方为：所述2mDNA1-bioB人工饲料的配方为：2mDNA1-bioB沉默表达载体 0.05 g/L，TbCSV质粒 0.05 g/L，蔗糖 300 g/ L；饲喂的烟粉虱为羽化1 d的烟粉虱，所述烟粉虱雌雄比为1:1，饲养条件温度25 ± 3℃，相对湿度60 % -70 %，光照周期L : D = 14 h : 10 h，饲养3 d，最终获得携带2mDNA1-bioB沉默表达载体的F₀代烟粉虱，所述F₀代烟粉虱生物素合成基因bioB表达被抑制、生物素含量降低；

（3）田间释放F₀代烟粉虱，用于与田间正常烟粉虱交配产卵，获得下代携带2mDNA1-bioB沉默表达载体的烟粉虱，下代携带2mDNA1-bioB沉默表达载体的烟粉虱生物素合成基因bioB表达被抑制、生物素含量降低。