[发明专利]沉默中华绒螯蟹Dsx基因的dsRNA以及其应用

说明书

本申请涉及中华绒螯蟹Dsx基因相关技术领域，尤其涉及沉默中华绒螯蟹Dsx基因的dsRNA以及其应用。制备该dsRNA的模板cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。用于制备该dsRNA的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。该dsRNA不仅可实现对中华绒螯蟹精巢特化Dsx基因的沉默，还能够调控中华绒螯蟹性别决定基因IAG的基因表达；该dsRNA对Dsx基因的沉默准确可靠、沉默效率高，为中华绒螯蟹单性化养殖及遗传改良提供了研究基础。

技术领域

本申请涉及中华绒螯蟹Dsx基因相关技术领域，尤其涉及沉默中华绒螯蟹Dsx基因的dsRNA以及其应用。

背景技术

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)，俗称河蟹，隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)。因其肉质鲜美、营养丰富而成为中国重要的水产养殖蟹类之一。在其生产过程中，根据不同需要，通过单性化养殖，实现河蟹全雄或全雌养殖可以节约养殖成本，提高生产效率，进而在满足消费者需求的同时创造出更大的经济效益。因此，中华绒螯蟹的性别决定与性腺分化机制越来越受到人们的关注。

Doublesex(Dsx)基因最早是在果蝇中被发现的，作为昆虫性别级联系统中的关键基因，Dsx基因的结构和功能在不同昆虫中具有保守性，可调节下游基因的表达来参与雌雄性别的决定和分化。Dsx基因编码的DSX蛋白主要包括两部分，其N端包含一个能与DNA结合的保守基序DM(doublesex and mab-3)结构域，此结构域是DSX蛋白结合下游靶标基因的重要位点；而C端的OD2结构域激活或者抑制下游靶标基因的表达，进而起到调控个体性腺分化的作用。研究发现，河蟹的Dsx基因与昆虫Dsx基因高度同源(见刘志强，中华绒螯蟹雌雄个体早期形态分化及雄性个体中性别相关基因的研究[D].上海海洋大学，2018)。虽然Dsx基因的功能在昆虫性别决定的研究中已阐明，但河蟹关于Dsx基因的报道还未见。因此，有必要在河蟹中开展Dsx基因的功能研究，并应用于河蟹的性别决定与性腺分化中。

发明内容

有鉴于此，本申请的目的在于针对Dsx基因的表达进行研究，以利于将其应用于中华绒螯蟹的性别决定和性腺分化研究中。

第一方面，本申请实施例公开了制备dsRNA的模板cDNA，所述模板cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，所述dsRNA用于沉默中华绒螯蟹Dsx基因。

第二方面，本申请实施例公开了所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。

第三方面，本申请实施例公开了连接有所述的模板cDNA的重组表达载体。

第四方面，本申请实施例公开了携带有所述的重组表达载体的宿主。

第五方面，本申请实施例公开了制备所述的dsRNA的方法，包括以下步骤：

获得所述模板cDNA；

PCR扩增，利用所述引物对对所述模板cDNA进行扩增，得到长度为571bp的靶序列；

构建重组表达载体，所述重组表达载体连接有所述靶序列片段；

获得转化有所述重组表达载体的大肠杆菌菌体；

诱导表达所述大肠杆菌菌体；以及

得到所述dsRNA，由所述大肠杆菌菌体诱导表达后，经过菌体裂解、RNA提取、变性、退火和纯化得到所述dsRNA。

在本申请实施例中，所述PCR扩增体系为：10×Buffer 5μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，cDNA模板1μL，Taq聚合酶1.0μL，dd H₂O补足50μL；所述PCR扩增反应条件为：98℃预变性30s；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共循环30次后；72℃延伸10min。