[发明专利]沉默中华绒螯蟹Dsx基因的dsRNA以及其应用

权利要求书

1.制备dsRNA的模板cDNA，所述模板cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，所述dsRNA用于沉默中华绒螯蟹Dsx基因。

2.用于制备权利要求1所述的dsRNA的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。

3.连接有权利要求2所述的模板cDNA的重组表达载体。

4.携带有权利要求3所述的重组表达载体的宿主。

5.制备权利要求1所述的dsRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

获得如权利要求1所述的模板cDNA；

PCR扩增，利用权利要求2所述的引物对对所述模板cDNA进行扩增，得到长度为571bp的靶序列片段；

构建重组表达载体，所述重组表达载体连接有所述靶序列片段；

获得转化有所述重组表达载体的大肠杆菌菌体；

诱导表达所述大肠杆菌菌体；以及

得到所述dsRNA，由所述大肠杆菌菌体诱导表达后，经过收集菌体、提取RNA、变性、退火和纯化得到所述dsRNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为：10×Buffer 5μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，cDNA模板1μL，Taq聚合酶1.0μL，dd H₂O补足50μL；所述PCR扩增反应条件为：98℃预变性30s；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共循环30次；72℃延伸10min。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，大肠杆菌菌体诱导表达后的步骤包括：

收集菌体，利用Trizol Reagent提取上述细胞总RNA后，于72℃水浴条件下对上述总RNA变性处理10min，自然冷却至室温后，退火即可形成靶向Dsx基因的dsRNA。

8.沉默中华绒螯蟹Dsx基因表达的方法，包括对中华绒螯蟹注射包含如权利要求1所述的dsRNA的试剂的步骤。

9.权利要求1所述的dsRNA或权利要求2所述的模板cDNA的应用，其特征在于，所述应用包括以下任一项：

(1)在中华绒螯蟹杂交育种中的应用；

(2)在中华绒螯蟹单性化养殖中的应用；

(3)在中华绒螯蟹遗传改良中的应用。