[发明专利]酵素生产方法及其酶解生产特定分子段氨基寡糖素应用

说明书

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种甲基营养型芽孢杆菌酵素的生产方法，以及用所述甲基营养型芽孢杆菌酵素生产特定分子段的氨基寡糖素的方法。通过甲基营养型芽孢杆菌液体发酵、固体发酵得到固体酵素；然后用所述固体酵素与壳聚糖酶解发酵，通过控制酶解时间可以得到特定分子量的氨基寡糖素，最后通过振动筛粗过滤，再经过微滤过滤机精过滤便可得到稳定的特定分子量的氨基寡糖素。本发明方法生产的氨基寡糖素分子量分布区间集中，适合精细化生产。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种甲基营养型芽孢杆菌酵素的生产方法及用其生产特定分子段的氨基寡糖素的方法。

背景技术

氨基寡糖素（壳寡糖）是新一代海洋生物农药，是壳聚糖的降解产物，无毒害、不污染环境。目前氨基寡糖素的生产方法主要有物理降解法，化学降解法和生物降解法。其中物理降解法对生产设备要求较高，存在收率较低、反应不充分、生产成本高等多种问题；化学降解法存在条件不易控制，选择性较差，有副产物分离纯化困难，目标产物难以控制等问题。生物降解法（酶解法）是应用最主流的方法，但是目前酶解法生产得到的壳寡糖产物的分子量分布区间还是有点广，所得壳寡糖产物的分子量区间普遍在1000-3000之间，如果只想要生产特定窄分子量范围的目标壳寡糖，现有的方法还是显得不够精细。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种甲基营养型芽孢杆菌酵素，用于酶解壳聚糖。

所述甲基营养型芽孢杆菌酵素通过液体发酵和固体发酵两道工序制备，如下:

1.液体发酵

1.1将甲基营养型芽孢杆菌种按5%重量比接种至LB液体培养基中，在温度为30-37℃，转速为180-200r/min条件下培养18-24h，得到甲基营养型芽孢杆菌种子液；

其中LB液体培养基配方：按重量计蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠1%，去离子水补至100%；

1.2将甲基营养型芽孢杆菌种子液按3%-5%重量比接种至扩大培养基中，在温度为30-37℃，转速为180-200r/min条件下培养36-48h，进行扩大培养，得到甲基营养型芽孢杆菌发酵液；

其中扩大培养基配方：按重量计玉米粉1.6%-2.4%、黄豆粕粉1.2%-1.8%、糖蜜0.4%-0.6%、NaCl 0.5%-1%、KH₂PO₄ 0.4%-0.6%、MgSO₄•7H₂O 0.16%-0.24%、CaCO₃ 0.04%-0.06%，水补至100%；

2.固体发酵

2.1在温度为30-37℃、湿度为85-99%的控温控湿无菌室中，将甲基营养型芽孢杆菌发酵液接种于固体培养基进行培养3-5天；

所述固体培养基配方：按重量计黄豆粕粉25%-30%、麦麸17%-20%、米糠11%-15%、稻壳5%-7%、糖蜜1%-2%、碳酸钙2%-3%、马铃薯浸出液补至100%；

其中所述马铃薯浸出液配制方法：加水将马铃薯煮沸，然后打碎，过滤，便可制得马铃薯浸出液；

2.2培养好之后，对培养产物进行35-45℃无菌烘干，使其含水量降至10%以下，即可得到固体甲基营养型芽孢杆菌酵素。

本发明的另一个目的是提供一种利用甲基营养型芽孢杆菌酵素酶解壳聚糖得到特定分子段的氨基寡糖素的生产方法。

所述生产方法具体如下：

Ⅰ在反应釜中加入壳聚糖 4.4%-6.6%，亚磷酸0.4%-0.6%，甲基营养型芽孢杆菌酵素0.4%-0.6%，纯净水补至100%；

Ⅱ打开搅拌器和恒温加热系统，50℃±2℃酶解发酵，即可得到氨基寡糖素混合液；