[发明专利]一种耐亚硫酸根重组葡萄汁酵母的制备方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到一种耐亚硫酸根重组葡萄汁酵母的制备方法，本发明通过将碱基序列如SEQ ID No.1所示的MET4基因转入葡萄汁酵母中，得到的重组葡萄汁酵母耐亚硫酸根能到40mM，比起始菌株的20mM要高50%，且在发明中，葡萄汁酵母过表达MET4基因会上调HOM3基因的表达量，上调HOM3基因的表达量，可以消耗更多培养基中的亚硫酸根，即它生存环境中的亚硫酸根，使环境中的亚硫酸根的浓度下降，进而使转化子能在含亚硫酸根量较高的情况下能续继生存或发酵，即更能耐亚硫酸根。此外，葡萄汁酵母过表达MET4基因，会引发发酵应激反应基因和热激蛋白基因的上调，进而会导致其耐亚硫酸根的能力进一步提升，有利于其在亚硫酸盐环境下持续发酵。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到一种耐亚硫酸根的重组葡萄汁酵母及其制备方法。

背景技术

葡萄酒品质在一定程度上取决于发酵过程的酵母种类或菌株特性。除了常见的酿酒酵母之外，葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)因其具低温发酵能力和能产生特殊的香味也常被用于葡萄酒酿造中。众所周知，亚硫酸盐是被广泛使用的一种防腐剂，对许多微生物有毒害作用，在发酵的过程中，在酵母的作用下还可使葡萄酒产生特殊的风味，目前还没有化合物可以完全代替这种添加剂。但在酿酒酵母细胞中，亚硫酸盐不仅会破坏细胞结构，还会与一些酶或代谢物结合，阻碍细胞正常的代谢活动，在发酵后期会严重影响酿酒菌株的发酵效率。因此，葡萄酒酿造酵母抗亚硫酸盐性被认为是葡萄酒酿造中非常重要的性状。

Met4p是一种转录因子，属于亮氨酸拉链蛋白家族。Met4p能够刺激甲氨酸生物合成通路中MET基因转录的正转作用因子，参与MET28和MET30的转录激活，通过组装MET4-MET28-MET31和MET4-MET28-MET32复合物，诱导谷胱甘肽的合成等方式进行抗硫胁迫。因此，Met4p在酿酒酵母受到硫胁迫时能够发挥重要的调节细胞稳态的主调控作用，但该基因在葡萄汁酵母中，其耐亚硫酸盐机理研究还未见报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种耐亚硫酸根重组葡萄汁酵母的制备方法，以解决背景技术中存在的问题。

为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：

一种耐亚硫酸根的重组葡萄汁酵母，所述葡萄汁酵母过表达MET4基因，所述MET4基因碱基序列如SEQIDNo.1所示。

进一步的，本发明还提供了一种耐亚硫酸根重组葡萄汁酵母的制备方法，包括以下步骤：

(1)MET4基因表达载体的构建：将NcoI、BglII酶切后并纯化后的Pgem-T-MET4小片段构建进同样被这两种酶酶切后的pCAMBIA1301，形成pCAMBIA1301-MET4重组质粒，并测序验证；

(2)基因转化：通过电转化将pCAMBIA1301-MET4转移到大肠杆菌DH5α中，涂在含有潮霉素(HYG)的LB培养基上进行扩培，收获细胞，提取并纯化质粒，将葡萄汁酵母感受态细胞和纯化后的质粒放入体积比为10∶1的电击杯中，使用Eppendorf电穿孔仪在1500V下混合并电击5ms，室温静置后，加入YEP培养基，然后在28℃条件下放置1h，在28℃和200rpm的摇床中培养2h后，在含HYG和亚硫酸盐的YPD培养基平板上挑选并获得转化后的葡萄汁酵母。