[发明专利]一种耐亚硫酸根重组葡萄汁酵母的制备方法

权利要求书

1.一种耐亚硫酸根的重组葡萄汁酵母，其特征在于，所述葡萄汁酵母过表达MET4基因，所述MET4基因碱基序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的一种耐亚硫酸根的重组葡萄汁酵母在果酒酿造中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述果酒为葡萄酒。

4.一种耐亚硫酸根重组葡萄汁酵母制备的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）MET4基因表达载体的构建：将NcoI、BglII酶切后并纯化后的Pgem-T -MET4小片段构建进同样被这两种酶酶切后的pCAMBIA1301，形成pCAMBIA1301-MET4重组质粒，并测序验证；

（2）基因转化：通过电转化将pCAMBIA1301-MET4转移到大肠杆菌DH5α中，涂在含有HYG的LB培养基上进行扩培，收获细胞，提取并纯化质粒，将葡萄汁酵母感受态细胞和纯化后的质粒放入体积比为10∶1的电击杯中，使用Eppendorf电穿孔仪在1500 V下混合并电击5 ms，室温静置后，加入YEP培养基，然后在28 ℃条件下放置1 h，在28℃和200 rpm的摇床中培养2 h后，在含HYG和亚硫酸盐的YPD培养基平板上挑选并获得转化后的葡萄汁酵母。

5.根据权利要求4所述的一种耐亚硫酸根重组葡萄汁酵母制备的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，将含pCAMBIA1301-MET4转移到大肠杆菌DH5α后进行扩培，具体包括以下步骤：

S1：涂在含有10mg/mL潮霉素（HYG）的LB固体培养基平板上，并在37 ℃条件下培养过夜，

S2：将大的转化菌落挑入含10 mg/mL HYG的3 mL LB液体培养基中，并在37 ℃条件下培养过夜，收获细胞，提取并纯化质粒；

所述LB固体培养基以质量比计包括：1%酵母提取物、1%胰蛋白胨、2%琼脂和0.5%氯化钠；所述LB液体培养基以质量比计包括：1%酵母提取物、1%胰蛋白胨和0.5%氯化钠。

6.根据权利要求4所述的一种耐亚硫酸根重组葡萄汁酵母制备的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，YEP培养基以质量比计包括：1%酵母提取物，1%蛋白胨，0.5%氯化钠，pH 7.5；YPD 培养基以质量比计包括：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%琼脂和2%葡萄糖。