[发明专利]一种人类椎间盘PROCR+

说明书

本发明提供一种人类椎间盘PROCR⁺髓核祖细胞的分离方法，包括：1)将髓核充分剪碎处理后，依次分别经胰蛋白酶、链霉蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化处理后，获得细胞悬液；2)将所述细胞悬液经裂解红细胞处理并经磁珠分选去除组织杂质后，以PBS⁺0.04％BSA重悬细胞获得细胞重悬液；3)将所述细胞重悬液中的细胞经PROCR流式细胞抗体染色然后通过流式细胞仪分选，对比了两种主流的PROCR克隆号抗体分选效率，优化了分选方案，最后即得人类椎间盘PROCR⁺髓核祖细胞。本发明还提供了根据上述分离方法获得的人类椎间盘PROCR⁺髓核祖细胞及其应用。本发明制备的髓核PROCR⁺细胞具有良好的克隆形成、自我更新和三系分化能力，为椎间盘退行性疾病的生物治疗策略提供了一种全新的种子细胞来源。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及干细胞培养技术，尤其涉及一种人类椎间盘PROCR⁺髓核祖细胞的分离方法。

背景技术

椎间盘退行性疾病(Degenerative Disc Disease，DDD)是以髓核退变为核心病理事件的高发疾患，其引起的腰腿痛、颈肩痛甚至瘫痪严重影响患者的工作能力和生活质量。随着社会人口老龄化加剧，颈腰痛的致残率和相关费用逐年增加，据WHO最新统计全球疾病的伤残调整寿命年(disability adjusted life year，DALY)排名，腰痛和颈痛分列第一位和第三位。因此，研究椎间盘退行性疾病发病机制和治疗策略有重要的战略意义和迫切的现实需求。

髓核变性是椎间盘退变的核心始动环节，现有针对椎间盘退行性疾病的临床治疗手段，均以缓解症状为目的，尚无修复病损髓核的治疗手段。而近年来，基于种子细胞移植/激活的生物治疗技术为髓核再生修复展现了全新的技术前景，而种子细胞的获取更是该研究领域的瓶颈问题和前沿热点。以往研究认为髓核内细胞成分简单，只存在脊索细胞和软骨细胞，这些细胞面临着获取及扩增困难或者诱导技术复杂等实际问题，距离临床应用还比较遥远。因此，急需寻找更加贴近临床需求的新型髓核种子细胞获取途径。

发明内容

本发明基于一种新型髓核祖细胞(nucleus pulposus progenitor cells,NPPC)，极具再生修复的潜力，作为一种自体原位的功能细胞，髓核祖细胞具有来源广泛、获取简便、生物安全性较好、功能可控性强等独特优势。因此，基于该髓核祖细胞的再生修复策略极具前景。

本发明提供了一种人类椎间盘PROCR⁺髓核祖细胞的分离方法，包括：

1)将髓核破碎处理后，依次分别经胰蛋白酶、链霉蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化处理后，获得细胞悬液；

2)将所述细胞悬液经裂解红细胞处理并经磁珠分选去除组织杂质后，以PBS⁺0.04％BSA重悬细胞获得细胞重悬液；

3)将所述细胞重悬液中的细胞经PE-PROCR流式抗体(克隆号：RCR-401)染色然后通过流式细胞仪分选，即得人类椎间盘PROCR⁺髓核祖细胞，所述流式细胞仪分选是通过包括下述步骤的方法实现的：

(1)创建FSC-A与SSC-A的点状图，划门以去除杂质；

(2)创建FSC-H与FSC-W的点状图，划门以除粘连体；

(3)创建SSC-H与SSC-W的点状图，再次划门以去除粘连体；

(4)创建SSC-H与APC-Cy7的点状图，划门去除死细胞；

(5)创建FSC-H与PE的点状图，划门分选PROCR⁺细胞。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)中所述胰蛋白酶消化处理是通过包括下述步骤的方法实现的：