[发明专利]一种人类椎间盘PROCR+

权利要求书

1.一种人类椎间盘PROCR⁺髓核祖细胞的分离方法，其特征在于，包括：

1)将髓核充分剪碎处理后，依次分别经胰蛋白酶、链霉蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化处理后，获得细胞悬液；

2)将所述细胞悬液经裂解红细胞处理并经磁珠分选去除组织杂质后，以PBS⁺0.04％BSA重悬细胞获得细胞重悬液；

3)将所述细胞重悬液中的细胞经PE-PROCR流式抗体染色然后通过流式细胞仪分选，即得人类椎间盘PROCR⁺髓核祖细胞，所述流式细胞仪分选是通过包括下述步骤的方法实现的：

(1)创建FSC-A与SSC-A的点状图，划门以去除杂质；

(2)创建FSC-H与FSC-W的点状图，划门以除粘连体；

(3)创建SSC-H与SSC-W的点状图，再次划门以去除粘连体；

(4)创建SSC-H与APC-Cy7的点状图，划门去除死细胞；

(5)创建FSC-H与PE的点状图，划门分选PROCR⁺细胞。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述胰蛋白酶消化处理是通过包括下述步骤的方法实现的：

向髓核组织中加入0.25％胰蛋白酶，每2克髓核组织需要胰蛋白酶10mL，于37℃静音混悬器上消化30分钟，300g/5min/4℃，离心，弃上清。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述链霉蛋白酶消化处理是通过包括下述步骤的方法实现的：

向经胰蛋白酶消化处理的髓核组织中加入0.2％链霉蛋白酶溶液，每2克髓核组织需要链霉蛋白酶溶液10mL，于37℃静音混悬器上消化组织1小时，300g/5min/4℃离心，弃上清。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述Ⅱ型胶原酶消化处理是通过包括下述步骤的方法实现的：

向经链霉蛋白酶消化处理后的髓核组织加入0.1％Ⅱ型胶原酶溶液，每2克髓核组织需要Ⅱ型胶原酶溶液10mL，于37℃静音混悬器上旋转消化2个小时，在消化过程中每隔半个小时观察消化结果，待组织基本消化完全时即停止消化。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中流式细胞仪参数配置如下：

FSC(Voltage E-1.Ampgain 7.21.Linear mode)、SSC(Voltage 271to 358.Ampgain1.00,Linear mode)主要阈值参数：FSC,value 162，辅助阈值参数：无。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中通过流式细胞仪分选PROCR⁺细胞过程中包括：

连接样品，以最慢流速运行，然后进行数据分析，最后以MSCBM培养基接收PROCR^-和PROCR⁺细胞；

优选地，所述最慢流速运行是通过包含以下流式细胞仪的配置参数实现的：Sheetpressure 4.5PSIG,sample pressure 5.0PSIG,12μL/min。

7.根据权利要求1-6所述的制备方法得到的人类椎间盘PROCR⁺髓核祖细胞。

8.如权利要求7所述的人类椎间盘PROCR+髓核祖细胞在制备椎间盘退行性疾病的生物治疗的药物中的应用。