[发明专利]低频引入突变的酶切打断建库方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种低频引入突变的酶切打断建库方法和试剂盒。其中，该酶切打断建库方法包括DNA酶切片段化和补平加A、接头连接、PCR扩增和文库纯化的步骤，其中，DNA酶切片段化和补平加A步骤中，通过控制常温DNA聚合酶的用量控制反复切割和链置换。应用本申请的技术方案，除了保证打断的效率和稳定性，同时也避免了由于打断引入大量的突变导致影响酶切打断在NGS测序过程中的应用，做到打断水平和超声相当的水平，使本申请的酶切打断能够在临床检测过程中得到很好的应用。

技术领域

本申请涉及高通量测序文库构建技术领域，具体而言，涉及一种低频引入突变的酶切打断建库方法和试剂盒。

背景技术

目前，高通量测序已在辅助诊断方面有不可替代的作用。高通量测序的建库环节是高通测序过程中的重要环节，为了未来更好的在临床方向的应用，通常在建库自动化和成本控制两个重要方面进行控制和优化。以前文库构建的打断一般是用超声打断的方式进行，但这种方式有两个明显的缺点，一个是打断成本过高，另一个是不利于自动化操作。

当前，解决上述两个问题的方案通常是利用酶切建库的方法，酶切建库可以更好的整合到自动化的操作中，且由于不需要超声打断，这部分成本也可以节省。虽然酶切建库可以解决超声打断的部分弊端，但也会引入很多点突变(SNP)和双方向假融合位点序列(Dual Stranded Artifact sequence，https://doi.org/10.1101/2020.01.30.927491)。由于酶切建库的核心思想是利用一种产生缺口的酶和一种聚合酶共同作用实现打断，只是实现了打断的目的，对引入突变的问题没有充分考虑。

一般的酶切打断方式主要有两种，一种是由一种酶切出缺口，之后用T7内切酶把这个缺口对面的序列切断(US8703462B2)，这种打断方式是能打断DNA，并且也很少引入突变，但是由于此种打断方式DNA损失严重，在效率上甚至还不如超声打断的方式，并且打断的长度不集中，也没有很好的得到应用。另一种打断方式是利用一种酶切出缺口，再用另一种聚合酶进行连置换的方式对DNA片段化，这种方式已经存在了很多年(Methods inenzymology,152,330-335 1987-01-01)，并且最近也不断有相似的专利出现。例如，US2019/0153453 A1是利用Nt.CviPII或NciI，Nt.CviPII或NciI是一种限制性内切酶的突变体，只能切割双链的一条链，搭配大肠杆菌聚合酶(20U)完成打断。CN111763664B也是相识的原理，都能实现DNA片段的打断，其大肠杆菌聚合酶的用量为0.05-1.0U/μL。可以理解，这些DNA打断方式，如图1所示，都是第一步产生缺口，第二步是经过常温聚合酶从缺口进行链置换的打断，第三步高温失活打断酶的同时末端加A。

由于以前在酶切打断时没有人重视酶切打断的引入突变问题，酶切过程中存在着大量的反复打断过程，由于链置换过程中会不断的引入突变，所以当第一次链置换的时候引入杂合突变，在后续的反复打断和链置换过程中另一个条链也被置换成突变的序列，所以经过长时间的打断，就会引入纯合的突变，如图2所示，经过多轮打断不可避免的产生大量的SNP突变。同样的道理，由于基因组上存在比较近的反向重复序列，在打断的过程中，由于在链置换的过程中有单链状态存在，所以反向重复区域会形成自己互补结构，这样自己会形成局部互补驱动链置换过程，这种结构在后续的打断和链置换过程中会形成颠倒的假的融合形式(https://doi.org/10.1101/2020.01.30.927491)，如图3所示，这种形式如果大量引入，会影响融合突变的准确检出。一般融合的发生也是有一段重复序列导致，重复序列被转座酶识别发生片段错接，准确的融合突变和SNP检测有重要的临床意义，但是酶切打断会大量的产生SNP和假的融合突变，所以目前虽然酶切建库比较节省成本和适应自动化，但是由于引入大量的突变也限制了酶切打断的大规模应用。

目前，应用者对酶切打断的效率都比较认可，因为和超声打断相比，其节省成本，且效率比较高。但影响酶切打断大规模应用的因素主要是酶切会引入大量突变，在检测体细胞突变时酶切建库引入的突变会影响检测这些突变的准确性。

发明内容