[发明专利]低频引入突变的酶切打断建库方法和试剂盒

权利要求书

1.一种低频引入突变的酶切打断建库方法，其特征在于，包括DNA酶切片段化和补平加A、接头连接、PCR扩增和文库纯化的步骤，其中，所述DNA酶切片段化和补平加A步骤中，通过控制常温DNA聚合酶的用量控制反复切割和链置换。

2.根据权利要求1所述的酶切打断建库方法，其特征在于，所述DNA酶切片段化和补平加A步骤中，所述常温DNA聚合酶的用量为0.001～0.045U/μL；

优选的，所述常温DNA聚合酶为选自大肠杆菌聚合酶I、Klenow大片段或Bst DNA聚合酶中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的酶切打断建库方法，其特征在于，所述DNA酶切片段化和补平加A步骤中，耐热DNA聚合酶的用量为0.05～0.2U/μL；

优选的，所述耐热DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的酶切打断建库方法，其特征在于，所述DNA酶切片段化和补平加A步骤中，所述常温DNA聚合酶的反应温度为25～32℃；优选为25℃；

优选的，所述常温DNA聚合酶的灭活温度为65℃；

优选的，所述常温DNA聚合酶的反应时间为25～30min；

优选的，所述常温DNA聚合酶的灭活反应时间为25～30min。

5.根据权利要求1所述的酶切打断建库方法，其特征在于，所述DNA酶切片段化和补平加A步骤中，打断酶溶液包括T4 GP32 0.01～0.03μg/μL、DNaseI 0.004～0.01U/μL、KlenowDNA聚合酶0.001～0.045U/μL、Taq DNA聚合酶0.05～0.2U/μLU/μL和50％甘油；

优选的，所述打断酶溶液包括T4 GP32 0.01μg/μL、DNase I 0.004U/μL、Klenow DNA聚合酶0.045U/μL、Taq DNA聚合酶0.2U/μL和50％甘油。

6.根据权利要求5所述的酶切打断建库方法，其特征在于，所述DNA酶切片段化和补平加A步骤中，所用的打断酶缓冲液包括Tris-HCl 5～15mM、NaCl 20～40mM、MgCl₂ 3～8mM、CaCl₂ 1～3mM、MnCl₂ 1～3mM、dNTPs 0.6～1mM、ATP 5～15mM；

优选的，所述打断酶缓冲液包括Tris-HCl 10mM、NaCl 30mM、MgCl₂ 5mM、CaCl₂2mM、MnCl₂ 2mM、dNTPs 0.6mM、ATP 10mM。

7.根据权利要求5或6所述的酶切打断建库方法，其特征在于，所述酶切打断建库方法包括：取所述打断酶缓冲液和所述打断酶溶液混合得到打断体系，向所述打断体系中加入待打断的DNA样本，25～32℃反应25～30min，然后65℃反应25～30min。

8.一种低频引入突变的酶切打断建库试剂盒，其特征在于，包括打断酶溶液和打断酶缓冲液：所述打断酶溶液包括常温DNA聚合酶，所述常温DNA聚合酶的反应终浓度为0.001～0.045U/μL；

更优选的，所述常温DNA聚合酶为选自大肠杆菌聚合酶I、Klenow大片段或Bst DNA聚合酶中的一种或多种；

优选的，所述打断酶溶液还包括耐热DNA聚合酶，所述耐热DNA聚合酶的反应终浓度为0.05～0.2U/μL；

更优选的，所述耐热DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。