[发明专利]人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法及应用

说明书

本发明公开了一种人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法及应用，包括：构建人BAF45D原核表达载体，获得重组质粒pGEX‑5X‑1‑BAF45D；GST‑BAF45D融合蛋白的原核表达：将所述重组质粒pGEX‑5X‑1‑BAF45D转入Rosetta(DE3)大肠杆菌，经IPTG诱导表达，获得菌体沉淀；破碎细菌，收集上清；GST‑BAF45D融合蛋白的纯化：将经过原核表达获得的上清经GST Resin离心纯化。该方法可实现菌体的高效表达，并获得高活性的GST‑BAF45D融合蛋白，从而能够将其与人胚胎干细胞裂解总蛋白结合孵育，可简便的筛选出与目的蛋白结合的人胚胎干细胞来源的蛋白，具有实际应用价值。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法，还涉及人BAF45D融合蛋白在寻找并鉴定人胚胎干细胞来源的真核蛋白的结合蛋白的应用。

背景技术

BAF45D，也被称为DPF2、double PHD fingers 2或双锌指蛋白2，其属于新型Krüppel型锌指蛋白d4蛋白家族。BAF45D基因定位于小鼠Chr 19，已知其在小鼠胚胎脑组织中表达；此外，BAF45D还定位于人11q13.1，位于人11号染色体长臂13区位置上，作为细胞内重要的基因表达调控因子之一，而这样一区域与多种形式肿瘤的发生有着密切的关系。

人胚胎干细胞具有自我更新和全能性的特点，可以分化为人体任意细胞，因而在再生医学中有着十分重要的应用价值。发现人胚胎干细胞相关蛋白质新的相互作用可以为其功能研究提供重要线索。BAF45D作为一种在人胚胎干细胞内表达丰富的蛋白，他的生物学功能可能与人胚胎干细胞诱导分化有关，稳定的筛选鉴定与已知蛋白相互作用的未知蛋白，对生物及医学领域分子机制方面的研究具有重要意义。然而目前，国际及国内上缺乏人BAF45D融合蛋白高效、高活性表达及纯化方法，更是缺乏利用BAF45D纯化蛋白寻找鉴定其人胚胎干细胞来源的结合蛋白的研究或同类研究成果。

发明内容

有鉴于此，本发明有必要提供一种人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法，提高菌体表达融合蛋白的效率，并保持较高蛋白活性，为后续利用该人BAF45D融合蛋白寻找并鉴定与人胚胎干细胞来源的真核蛋白的结合蛋白提供基础。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法，包括下列步骤：

构建人BAF45D原核表达载体，获得重组质粒pGEX-5X-1-BAF45D；

GST-BAF45D融合蛋白的原核表达：将所述重组质粒pGEX-5X-1-BAF45D转入Rosetta(DE3)大肠杆菌，经IPTG诱导表达，获得菌体沉淀；破碎细菌，收集上清；

GST-BAF45D融合蛋白的纯化：将经过原核表达获得的上清经GST Resin离心纯化。

进一步方案，所述IPTG诱导表达的参数为：采用终浓度为0.3mM IPTG，30℃、250rpm震荡培养诱导表达5h。

进一步方案，所述IPTG诱导表达的步骤，具体为：

挑取已转入质粒大肠杆菌菌种GST-BAF45D-Rosseta接种于LB液体培养基中，震荡过夜，获得过夜培养物；

将所述过夜培养物接种到LB液体培养基中，震荡培养至OD₆₀₀＝0.4-0.8后，加入100mM IPTG至终浓度为0.3mM，30℃、250rpm震荡培养诱导表达5h后，离心培养物，弃去上清，获得菌体沉淀。

进一步方案，所述破碎细菌的步骤，具体为：预冷细菌裂解液，以100mL菌液沉淀比6-8mL细菌裂解液的比例将菌体沉淀悬起，收集后进行冰浴超声破碎细菌，收集上清。