[发明专利]人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法及应用

权利要求书

1.一种人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，包括下列步骤：

构建人BAF45D原核表达载体，获得重组质粒pGEX-5X-1-BAF45D；

GST-BAF45D融合蛋白的原核表达：将所述重组质粒pGEX-5X-1-BAF45D转入Rosetta(DE3)大肠杆菌，经IPTG诱导表达，获得菌体沉淀；破碎细菌，收集上清；

GST-BAF45D融合蛋白的纯化：将经过原核表达获得的上清经GST Resin离心纯化。

2.如权利要求1所述的人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述IPTG诱导表达的参数为：采用终浓度为0.3mM IPTG，30℃、250rpm震荡培养诱导表达5h。

3.如权利要求1所述的人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述IPTG诱导表达的步骤，具体为：

挑取已转入质粒大肠杆菌菌种GST-BAF45D-Rosseta接种于LB液体培养基中，震荡过夜，获得过夜培养物；

将所述过夜培养物接种到LB液体培养基中，震荡培养至OD₆₀₀＝0.4-0.8后，加入100mMIPTG至终浓度为0.3mM，30℃、250rpm震荡培养诱导表达5h后，离心培养物，弃去上清，获得菌体沉淀。

4.如权利要求1所述的人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述破碎细菌的步骤，具体为：预冷细菌裂解液，以100mL菌液沉淀比6-8mL细菌裂解液的比例将菌体沉淀悬起，收集后进行冰浴超声破碎细菌，收集上清。

5.如权利要求4所述的人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述细菌裂解液的组成为50mM Tris、1mM EDTA、1％TritonX100、5mM DTT、2mM PMSF，pH＝8。

6.如权利要求4所述的人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述超声的参数具体为：40％-60％功率425W，超声4s，停8s，工作4-6min。

7.如权利要求1所述的人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述GSTResin离心纯化的步骤，具体为：

取30-50μL GST Resin与1500-2000μL GST-BAF45D-Rosseta细菌裂解的GST-BAF45D总蛋白，4℃孵育3小时，收集沉淀；使用1000-2000μL细菌裂解液洗杂质蛋白，在冰上振摇5min,收集沉淀；重复清洗杂质蛋白3次，收集沉淀，获得纯化后的GST-BAF45D融合蛋白。

8.一种寻找并鉴定人胚胎干细胞来源的真核蛋白的结合蛋白的方法，其特征在于，包括下列步骤：

提供纯化的GST-BAF45D融合蛋白，其采用如权利要求1-7任一项所述的人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法获得；

采用GST-pull down方法将所述GST-BAF45D纯化蛋白与人胚胎干细胞来源的真核总蛋白结合，寻找鉴定人胚胎干细胞来源的结合蛋白。

9.如权利要求8所述的寻找并鉴定人胚胎干细胞来源的真核蛋白的结合蛋白的方法，其特征在于，所述人胚胎干细胞来源的真核总蛋白选自H9细胞蛋白、NCCIT细胞蛋白或纯化后的His-SMAD3蛋白。

10.如权利要求8所述的寻找并鉴定人胚胎干细胞来源的真核蛋白的结合蛋白的方法，其特征在于，所述GST-pull down方法的步骤具体为：

将所述GST-BAF45D融合蛋白和600-1000μL人胚胎干细胞来源的真核总蛋白于4℃旋转孵育过夜，收集沉淀；沿壁缓慢加入1-2mL NP-40裂解液清洗beads，收集沉淀，并重复清洗beads 5-6次；向收集的沉淀中加入SDS上样缓冲液，连同Input一起100℃煮沸4-6min；经SDS-PAGE处理后IB验证。