[发明专利]一种新型水禽星状病毒重组融合蛋白、制备方法及其应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种新型水禽星状病毒重组融合蛋白、制备方法及其应用。本发明通过对新型水禽星状病毒CAP蛋白抗原表位密集区进行原核表达，得到免疫原性良好的重组蛋白，并用纯化的重组蛋白作为包被抗原，建立新型水禽星状病毒抗体间接ELISA检测方法，与小鹅瘟病毒、禽流感病毒（H5+H7）、新城疫病毒、坦布苏病毒的阳性血清无交叉反应性，说明该方法具有良好的灵敏性和特异性；在临床样本检测时，该方法与Western Blot方法检测结果具有较好的一致性，能够为新型水禽星状病毒抗体阳性种水禽的监测及临床诊断提供一种有力的工具。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种新型水禽星状病毒重组融合蛋白、制备方法及其应用。

背景技术

新型水禽星状病毒（Astrovirus, AV）是一种新近发现的、以引起鹅和鸭内脏及关节痛风为主要临床特征的病原微生物，可水平传播和经卵垂直传播。临床上主要表现为关节肿大、跛行、厌食和腹泻等症状。剖检可见肾脏高度肿大及尿酸盐沉积，内脏型痛风和关节型痛风为其特征性病理变化。病禽临床表现与营养性、中毒性和其他感染性元素造成的痛风症状类似，通过临床诊断难以区分，给该类疾病的防治造成巨大干扰。

新型水禽星状病毒又称为鹅星状病毒（Goose Astrovirus, gAstV），是一种无囊膜、呈二十面体对称的单股正链RNA病毒。基因组全长约6.8-7.9kb，包括5’非编码区（UTR）、3个开放阅读框（ORF1a、ORF1b、ORF2）、3’UTR和多聚腺苷酸尾。其中，ORF1a和ORF1b主要编码包括RNA依赖性的RNA聚合酶、丝氨酸蛋白酶、核定位信号等在内的非结构蛋白，ORF2编码的衣壳蛋白（CAP）是刺激机体产生保护性抗体的主要抗原蛋白。

自2017年，由新型水禽星状病毒引起的雏鹅痛风在我国江苏、安徽、山东等多地暴发，患病动物主要表现为精神沉郁、厌食、麻痹，剖检可见脏器表面和关节腔内有大量尿酸盐沉积。该病主要影响5-20日龄雏鹅，发病率约为80%，死亡率可达70%，严重影响养鹅业的健康发展。研究结果显示，患病种鹅所产鹅胚的受精率及孵化率显著下降，且患病雏鹅可通过粪便向外排毒，污染环境，说明新型水禽星状病毒可通过垂直和水平两种方式在鹅群中传播。2020年，Tang等从患有内脏痛风的樱桃谷鸭体内分离到一株鸭源新型水禽星状病毒，该病毒与gAstV同源性为97.6%-99.56%，说明新型水禽星状病毒具有在水禽间跨种传播的潜在风险。

目前针对新型水禽星状病毒的检测方法主要包括病原分离鉴定法、荧光定量PCR、环等温介导扩增技术和免疫层析法。其中，病原分离鉴定主要通过接种鹅胚或感染原代鹅胚肾细胞，但新型水禽星状病毒阴性鹅胚较难获得且原代鹅胚肾细胞不易分离培养，加上一般需要连传三代才可能出现鹅胚死亡或细胞病变，耗时较长。相比之下，荧光定量PCR和环等温介导扩增技术以高灵敏度和易于现地检测而被广泛用于病原的早期鉴定。免疫层析技术通过将新型水禽星状病毒特异性抗体吸附到胶体金颗粒表面，结合侧向流检测试纸条技术，实现病原的快速检测。但以上方法均是针对新型水禽星状病毒进行病原学检测，缺乏相应的抗体检测方法来评估鹅群中血清阳性率及免疫效果评价。

发明内容

针对目前现有针对新型水禽星状病毒大多进行病原学检测，缺乏相应的抗体检测法来评估鹅群中血清阳性率及免疫效果评价的缺陷和问题，本发明提供一种新型水禽星状病毒重组融合蛋白、制备方法及其应用。

本发明解决其技术问题所采用的方案是：一种新型水禽星状病毒重组融合蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）分析鉴定水禽星状病毒衣壳蛋白抗原表位密集区，根据抗原表位密集区设计特异性引物；

（2）利用特异性引物对水禽星状病毒毒株Cap蛋白羧基端的抗原表位密集区进行扩增，克隆该片段至pET-32a载体中，测序鉴定获得重组质粒pET-32a-shCAP；