[发明专利]一种新型水禽星状病毒重组融合蛋白、制备方法及其应用

权利要求书

1.一种新型水禽星状病毒重组融合蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）分析鉴定新型水禽星状病毒衣壳蛋白抗原表位密集区，根据抗原表位密集区设计特异性引物；所述特异性引物为：

Cap EcoRV F： gccatggctgatatcAGCAGGATTTATCAGACAGTTC；

Cap XhoI R： gtggtggtgctcgagTCATGACCAATTAATTAGGACTG；

（2）利用特异性引物对新型水禽星状病毒HNXX-6/China/2020株Cap蛋白羧基端的抗原表位密集区进行扩增，利用同源重组技术与经EcoRV 和XhoI酶切线性化的pET-32a载体连接，获得重组质粒pET-32a-shCAP；

（3）将重组质粒转化到感受态细胞中，经在IPTG浓度0.4mM/ml、27℃条件下诱导16h，包涵体纯化，透析和western-blot鉴定，获得免疫原性良好的重组蛋白shCAP。

2.一种检测新型水禽星状病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1制备方法制备的重组蛋白shCAP抗原包被、水禽星状病毒阳性血清、水禽星状病毒阴性血清、一抗血清、HRP标记抗鹅IgY二抗、封闭液、稀释液、PBST洗涤液、TMB显色液、终止液。

3.根据权利要求2所述的检测新型水禽星状病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述重组蛋白shCAP抗原包被浓度为2mg/L。

4.根据权利要求2所述的检测新型水禽星状病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述封闭液为5g/L的BSA ，封闭条件为4℃过夜封闭。

5.一种检测新型水禽星状病毒抗体的ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）如权利要求1所述的重组蛋白shCAP的制备：以新型水禽星状病毒衣壳蛋白抗原表位密集区设计特异性引物，根据引物对GenBank: MW592379新型水禽星状病毒毒株HNXX-6/China/2020株Cap蛋白羧基端的抗原表位密集区进行扩增，克隆该片段至pET-32a载体中，测序鉴定获得重组质粒pET-32a-shCAP；将重组质粒转化到感受态细胞中，经IPTG诱导表达、包涵体纯化、透析和western-blot鉴定得到免疫原性良好的重组蛋白shCAP；

（2）水禽星状病毒阳性对照血清、水禽星状病毒阴性对照血清的筛选：将重组蛋白shCAP，以1:50倍稀释的鹅血清作为一抗，1:5000倍稀释的HRP标记兔抗鹅IgY作为二抗进行Western Blot鉴定，根据鉴定结果筛选出阳性和阴性血清；

（3）将1-12mg/L的重组蛋白shCAP用缓冲液包被ELISA板，PBST洗涤后，加入封闭液封闭；再经PBST洗涤后，加入新型水禽星状病毒阳性及阴性血清，加入一抗孵育和二抗孵育，洗涤后加入显色液、终止液。

6.根据权利要求5所述的检测新型水禽星状病毒抗体的ELISA试剂盒制备方法，其特征在于：所述重组蛋白shCAP包被浓度为2mg/L；封闭液为5g/L的BSA、封闭条件为 4℃过夜封闭；血清稀释度为1:50、血清作用时间为37℃ 30min；二抗稀释度为1：10000、二抗作用时间为37℃ 30min，显色条件为37℃ 15min。

7.如权利要求1所述制备方法制备的重组蛋白和/或如权利要求2所述的ELISA试剂盒在检测新型水禽星状病毒方面的应用，该应用不以疾病检测和/或治疗为目的。