[发明专利]用于有毒蘑菇环鳞鹅膏鉴定的引物组、试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种用于有毒蘑菇环鳞鹅膏鉴定的引物组、试剂盒和方法，所述引物组包括引物AconF、qAconR，其核苷酸序列为：AconF：GTCTCTCTTCTTGCTTGTTTC，qAconR：AAATCCAAAACACACTCAAAAAGAGC；鉴定方法包括如下步骤：1)提取待测样品的基因组DNA；2)采用所述的引物组或者试剂盒，对提取的基因组DNA进行PCR扩增；3)检测PCR扩增产物中是否含有目的扩增片段，含有目的扩增片段的样品鉴定为环鳞鹅膏，本发明建立了具有广泛适用性的有毒蘑菇环鳞鹅膏快速鉴定技术体系，革新检测手段和措施，实现有毒蘑菇快速鉴定。

技术领域

本发明涉及蘑菇种质鉴定技术领域，具体涉及一种用于有毒蘑菇环鳞鹅膏鉴定的引物 组、试剂盒和方法。

背景技术

一些有毒菌类与可食菌类外形相似、且生长季节和生长环境相同，混杂生长在一起，容 易被人当成可食菌类采用。而误食野生毒蘑菇可能会造成急性肝损害、急性肾衰竭、肠胃炎 等严重后果。

常见野生毒蘑菇中，鹅膏科(Amanitaceae)鹅膏属(Amanita)部分真菌因含有鹅膏肽 类毒素而具有致毒性，如环鳞鹅膏(Amanita concentrica)，该真菌收录于生态环境部中国科 学院发布的《中国生物多样性红色名录-大型真菌卷》名录中，并且被评估为DD等级。

在误食有毒蘑菇急救中存在事发突然、形态学鉴定难等棘手难题，且目前我国对有毒生 物危害整体关注与研究较少，没有形成成熟的检测鉴定技术方法、试剂和标准，无法及时诊 断出中毒原因、甚至出现误诊，给人民生命安全和健康带来了重大隐患。所以，开展有毒蘑 菇快速定性检测技术研究具有重要意义。

发明内容

针对上述领域存在的空白和需求，本发明提供一种能够快速、准确鉴定有毒蘑菇环鳞鹅 膏的引物组、试剂盒，具体技术方案如下：

一种用于有毒蘑菇环鳞鹅膏鉴定的引物组，所述引物组包括引物AconF、qAconR，其 核苷酸序列为：

AconF：GTCTCTCTTCTTGCTTGTTTC，

qAconR：AAATCCAAAACACACTCAAAAAGAGC。

在另一技术方案中，所述引物组还包括探针AconU，探针AconU的核苷酸序列为：AGGCAGCCTTGGCACTGTTCAGGT；

优选探针AconU的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；进一步优选所述 荧光报告基团为VIC，所述荧光淬灭基团为BHQ1。

一种用于有毒蘑菇环鳞鹅膏鉴定的试剂盒，包含上述的引物组，还包含PCR扩增或者 实时荧光PCR扩增的反应试剂。

所述的试剂盒，还包括DNA提取试剂、阳性对照和阴性对照，所述PCR扩增或者实时荧光PCR扩增的反应试剂包括DNA聚合酶和DNA聚合酶缓冲液。

本发明的另一方面提供一种鉴定有毒蘑菇环鳞鹅膏的方法，包括如下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)采用上述的引物组或者上述的试剂盒，对提取的基因组DNA进行PCR扩增；

3)检测PCR扩增产物中是否含有目的扩增片段，含有目的扩增片段的样品鉴定为环鳞 鹅膏阳性，所述目的扩增片段的大小为341bp。

所述的方法，所述PCR扩增的反应体系为：总体积25μl，其中，2×Taq PCRMasterMix 12.5μl、浓度为10μM的正反向引物各1μl、基因组DNA 1μl、余量为ddH2O；所述步骤2) 中PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s， 35个循环。