[发明专利]一种利用脐带血单个核细胞生产自然杀伤细胞的方法

说明书

本申请属于生物技术领域，尤其涉及一种利用脐带血单个核细胞生产自然杀伤细胞的方法，将从脐带血中分离的单个核细胞混合物与同源脐带间充质干细胞共进行共培养处理，从而将所有种类的单个核细胞扩增3‑15倍，然后将单个核细胞混合物中除NK细胞以外的其他细胞诱导分化为NK细胞，再进行扩增处理，扩增倍数可达195倍以上，最大效率利用单位脐带血中的单个核细胞，采用本方法扩增生产的NK细胞与原单位脐带血中的NK细胞相比，数量上可增加几百甚至数千倍。

技术领域

本申请属于生物技术领域，尤其涉及一种利用脐带血单个核细胞生产自然杀伤细胞的方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。NK细胞不同于T、B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。在免疫系统中，NK细胞充当身体防御的前线，它们可以识别并杀死癌细胞以及被病毒感染的细胞，由于这一重要功能，目前许多研究都集中在研究如何将NK细胞用作免疫治疗癌症的基础。

然而，分离外周血以获得大量的NK细胞已被证明是困难的，因为只有5％-15％的循环血液淋巴细胞是NK细胞，此外，从外周血淋巴细胞中分离通常会导致淋巴细胞的异质性群体，NK细胞的产量仅为10-20％。由于外周血原代NK细胞在低温保存后细胞毒性降低，因此它们的使用更加复杂。虽然冷冻保存的低产量和细胞毒性损失可以通过细胞因子支持和饲养细胞扩增部分克服，但这种方法使外周血NK细胞不是“现成”治疗的最佳选择。

相比之下，脐带血来源的NK细胞在冷冻保存后恢复良好，是使用原代NK细胞进行“现成”治疗的潜在候选者，尽管脐带血中NK细胞的百分比高于外周血中的NK细胞，但缺点是每个脐带血单位的NK细胞数量有限，难以获取大规模NK细胞。

发明内容

本申请的目的在于提供一种利用脐带血单个核细胞生产自然杀伤细胞的方法，旨在一定程度上解决难以获取大量自然杀伤细胞的问题。

为实现上述申请目的，本申请提供一种利用脐带血单个核细胞生产自然杀伤细胞的方法，包含以下步骤：

对脐带血进行分离处理得到脐带血单个核细胞；

对与脐带血同源的脐带进行分离与培养处理得到脐带间充质干细胞，分离与培养处理的第一完全培养基中包含一种或多种第一细胞因子；

对脐带血单个核细胞和脐带间充质干细胞进行共培养处理得到扩增后脐带血单个核细胞，共培养处理的第二完全培养基中包含一种或多种第二细胞因子；

将扩增后脐带血单个核细胞进行诱导分化处理得到NK细胞，诱导分化处理的诱导分化培养基中包含一种或多种第三细胞因子；

将NK细胞进行扩增处理得到扩增后NK细胞，扩增处理的扩增培养基中包含一种或多种第四细胞因子。

进一步地，第一完全培养基包含UltraCULTURE Serum-free Medium无血清培养基、XF Basal Medium间充质干细胞无血清培养基、MSC XF基础培养基中的一种或多种，和/或

第一细胞因子包含Ultroser G serum substitute血清替代物、XF Supplements、MSC XF补充剂混合物；

第二完全培养基包含Stemline I扩增培养基、Stemline II扩增培养基、SFEM扩增培养基、SFEM II扩增培养基中的一种或多种，和/或

第二细胞因子包含SCF、G-CSF和GM-CSF；

诱导分化培养基包含RPMI 1640基础培养基、SCGM无血清培养基、KBM581无血清培养基、X-VIVO 10无血清培养基中的一种或多种，和/或