[发明专利]一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及其应用方法

权利要求书

1.一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，包括：微流控芯片、生物素标记的抗体、抗体稀释液、样本稀释液、细胞固定液、细胞通透液和细胞荧光染色液，所述微流控芯片的结构片上有设置有纳米微阵列通道，所述微阵列通道上包被有链酶亲和素磁微粒。

2.根据权利要求1所述的一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的抗体的组分包括含有生物素标记的鼠抗HLA-G抗体、生物素标记的鼠抗CA19-9抗体和生物素标记的鼠抗CA125抗体。

3.根据权利要求1所述的一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述抗体稀释液的组分包括Tris-HCL缓冲液、牛血清白蛋白和叠氮钠。

4.根据权利要求1所述的一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液为磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求1所述的一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述细胞固定液为4％多聚甲醛液。

6.根据权利要求1所述的一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述细胞通透液0.2％Triton-X100。

7.根据权利要求1所述的一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述细胞荧光染色液的组分包括含有荧光标记抗体Alexa Fluor 488荧光素标记的细胞角蛋白抗体、PE标记的抗人CD45抗体和核酸染料DAPI。

8.一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、外周血单核细胞的分离

a)取样品10ml，放入50ml试管中，轻轻混匀；

b)将试管直立静置于室温或37℃温箱中，待红细胞自然沉降；

c)用毛细管吸取位于红细胞层上面的富含白细胞的细胞悬液，移入另一试管中；

d)加入无Ca2+、Mg2+Hank’s液至离试管口3cm处，混匀，离心，弃上清，同法重复洗涤两次；

e)沉淀细胞用适量10％～20％灭活小牛血清的Hank’s液重悬，细胞悬液作为处理后样本用于后续检测；

S2、捕获抗体的包被

a)采用样本稀释液清洗微流控芯片；

b)将生物素标记的抗体添加到PBS无菌缓冲液溶液中，混匀成抗体捕获工作液，用注射器将抗体捕获工作液注入到微流控芯片中，然后将微流控芯片置于湿盒中孵育；

c)用磷酸盐无菌缓冲液溶液清洗包被了捕获抗体的微流控芯片，除去残留在微流控芯片中的捕获抗体工作液；

d)封闭芯片；

S3、循环肿瘤细胞的捕获

a)用无菌样本稀释液清洗微流控芯片3次；

b)将上述步骤S1制备的细胞悬液用注射器注入包被完成的微流控芯片中，室温静置；

c)将细胞固定液用注射器注入微流控芯片，静置；

d)用无菌样本稀释液清洗微流控芯片；

S4、循环肿瘤细胞的免疫荧光染色

a)用无菌样本稀释液清洗微流控芯片；

b)将含有抗体标记的细胞荧光染色液用注射器注入微流控芯片，孵育；

c)用无菌样本稀释液清洗微流控芯片；

d)将核酸荧光染色剂注入微流控芯片，静置；

e)置于荧光倒置显微镜下观察。