[发明专利]一种用于检测D-阿洛酮糖的试剂盒及检测方法

说明书

本发明提出了一种用于检测D‑阿洛酮糖的试剂盒及检测方法，涉及检测技术领域。该试剂盒包括：试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ、试剂Ⅳ以及试剂Ⅴ。其中，试剂Ⅰ为磷酸盐缓冲液，试剂Ⅱ的主要成分为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，试剂Ⅲ的主要成分为核糖醇脱氢酶，试剂Ⅳ的主要成分为D‑阿洛酮糖。利用该试剂盒可在30分钟内完成96样本的检测，能够快速、准确地反映出样品中D‑阿洛酮糖的浓度或含量。利用该试剂盒在检测过程中不受D‑果糖及其他单糖等干扰物的影响，可应用于检测KEase酶促反应过程中D‑果糖至D‑阿洛酮糖的转化量以及筛选KEase酶变体。利用该试剂盒的检测过程中无需使用大型仪器设备，可显著降低检测成本。

技术领域

本发明涉及检测技术领域，具体而言，涉及一种用于检测D-阿洛酮糖的试剂盒及检测方法。

背景技术

阿洛酮糖是稀有糖家族的重要成员，只存在于少数植物和某些细菌中，含量极低。随着肥胖和糖尿病等代谢综合征的发病率在世界范围内迅速增加，营养(功能性食品)和健康问题越来越受到关注。D-阿洛酮糖因具有控血糖、保护胰岛、抗氧化等诸多功效，已逐渐成为制药、保健和食品工业的研究热点。

然而，D-阿洛糖的应用受到其稀缺性的限制。从自然资源中提取D-阿洛酮糖生产不现实，会消耗大量资源，增加生产成本，破坏环境。另一方面D-阿洛酮糖的化学合成很困难，会产生有毒副产品，不适合用于食品。因此，简单、低成本、安全的阿洛酮糖生产工艺已成为阿洛酮糖商业化的主要研究方向。目前，酶法合成D-阿洛酮糖目前已成为领域内首选的合成方法。已经筛选并鉴定的酮糖3-差向异构酶(ketose-3-epimerase，KEase)至少有20种，包括：D-塔格糖3-差向异构酶(DTEase)、D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAEase)和L-核酮糖3-差向异构酶(LREase)等。但其中大多数的酶对D-果糖的催化活性较低且热稳定性较差，这大大的限制了生物酶法生产D-阿洛酮糖的工业实际应用。因此，新酶的挖掘以及酶的分子改造以获得高活性高热稳定性酶分子已成为科学研究领域和工业实际应用迫切需要解决的首要问题。对新酶的挖掘以及酶分子的改造的关键是建立方法使得能够快速有效地从大型酶数据库或酶突变体库中识别出改良的酶分子。目前定量分析D-阿洛酮糖的方法主要为色谱法，包括：薄层色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法等，其中最常用的是高效液相色谱。这些方法虽然准确，但不适合对D-阿洛酮糖的高通量分析，而且由于测定过程需要消耗大量时间和成本过高，不允许对在酶定向进化筛选运动中所产生的大规模变异体库进行高通量筛选。因此，开发一种高效、灵敏且适合高通量筛选的试剂及检测方法来定量检测样品中D-阿洛酮糖的浓度(含量)并筛选酮糖3-差向异构酶是当前迫切需要的。

发明内容

鉴于上述问题，本发明提供一种用于检测D-阿洛酮糖的试剂盒及检测方法，具有高效高通量、高灵敏度、不易受其他糖类分子干扰的特点。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

一方面，本申请实施例提供一种用于检测D-阿洛酮糖的试剂盒，包括：试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ、试剂Ⅳ、以及试剂Ⅴ；其中，试剂Ⅰ为磷酸盐缓冲液，试剂Ⅱ的主要成分为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，试剂Ⅲ的主要成分为核糖醇脱氢酶，试剂Ⅳ的主要成分为D-阿洛酮糖，试剂Ⅴ为NADH荧光标定检测试剂。

在本发明的一些实施例中，所述试剂Ⅳ为溶解于试剂Ⅰ中的D-阿洛酮糖，其中D-阿洛酮糖的浓度为0-0.4μM；所述试剂Ⅲ为溶解于试剂Ⅰ中的核糖醇脱氢酶，其中核糖醇脱氢酶的浓度为5～10mg/mL；所述试剂Ⅱ为溶解于试剂Ⅰ中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为0-0.4μM。

在本发明的一些实施例中，所述试剂Ⅰ由如下浓度的组分组成：KH₂PO₄ 0.01～0.5mg/mL，KCl 0.05～1.0mg/mL，NaCl 3.0～10.0mg/mL，Na₂HPO₄ 0.3～2.0mg/mL。