[发明专利]一种用于检测D-阿洛酮糖的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于检测D-阿洛酮糖的试剂盒，其特征在于，包括：试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ、试剂Ⅳ、以及试剂Ⅴ；其中，试剂Ⅰ为磷酸盐缓冲液，试剂Ⅱ的主要成分为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，试剂Ⅲ的主要成分为核糖醇脱氢酶，试剂Ⅳ的主要成分为D-阿洛酮糖，试剂Ⅴ为NADH荧光标定检测试剂。

2.根据权利要求1所述的用于检测D-阿洛酮糖的试剂盒，其特征在于，所述试剂Ⅳ为溶解于试剂Ⅰ中的D-阿洛酮糖，其中D-阿洛酮糖的浓度为0-0.4μM；所述试剂Ⅲ为溶解于试剂Ⅰ中的核糖醇脱氢酶，其中核糖醇脱氢酶的浓度为5～10mg/mL；所述试剂Ⅱ为溶解于试剂Ⅰ中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为0-0.4μM。

3.根据权利要求1或2所述的用于检测D-阿洛酮糖的试剂盒，其特征在于，所述试剂Ⅰ由如下浓度的组分组成：KH₂PO₄ 0.01～0.5mg/mL，KCl 0.05～1.0mg/mL，NaCl 3.0～10.0mg/mL，Na₂HPO₄ 0.3～2.0mg/mL。

4.一种利用权利要求1或2所述的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将试剂Ⅰ的pH调至6.5～10，将试剂Ⅱ和试剂Ⅰ混合得到混合液；

2)用试剂Ⅰ对试剂Ⅳ进行梯度或倍数稀释，得到一组具有不同D-阿洛酮糖浓度的稀释溶液；以摩尔浓度计算，稀释溶液中D-阿洛酮糖的浓度最高不超过混合液中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度；

3)将混合液分别与步骤2)获得的各稀释溶液等体积混合，向每个样品中加入适量试剂Ⅲ，37℃反应15min；之后反应后的样品混合液各取出50μL，加入适量试剂Ⅴ，37℃反应30min后检测每个样品在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值，以含有0μM阿洛酮糖样品反应后在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值为标准值；

4)根据步骤3)反应前每个样品的D-阿洛酮糖浓度以及标准值与每个样品在反应后相对荧光值差值作D-阿洛酮糖浓度与相对荧光值差值的标准曲线，同时将获得的相对荧光值差值中以最大值和最小值为端点构成的区间作为参考区间；

5)用试剂Ⅰ对待测样品进行梯度或倍数稀释，将混合液分别与稀释后的各样品等体积混合，向每个样品中加入适量试剂Ⅲ，37℃反应15min；之后反应完的样品混合液各取出50μL加入适量试剂Ⅴ，37℃反应30min后检测每个样品在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值，以含有0μM阿洛酮糖的样品反应后在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值为标准值；

6)计算标准值与每个样品在反应后的相对荧光值差值，当有标准值与样品的相对荧光值差值未处于步骤4)获得的参考区间内时，则可根据相对荧光单位参照步骤4)获得的标准曲线计算得到样品对应的D-阿洛酮糖浓度，最后根据步骤5)中样品对应的稀释梯度或倍数换算即可得到待测样品中D-阿洛酮糖的浓度；如果所有标准值与样品的相对荧光差值均不在步骤4)获得的参考区间内，则需重新执行步骤5)，其中对待测样品的稀释需采用新的稀释梯度或倍数，直至有稀释后的样品相对荧光值差值单位处于步骤4)获得的参考区间内。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)获得的混合液中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为0-0.4μM；所述步骤2)中，试剂Ⅳ经梯度或倍数稀释得到的稀释溶液组中，D-阿洛酮糖的浓度在0～0.4μM的浓度范围内分布；所述步骤3)及步骤5)中，试剂Ⅲ的添加量应满足：每毫升反应体系中核糖醇脱氢酶的含量不低于0.1mg。