[发明专利]基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法

说明书

本发明公开了一种基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，包括以下步骤：S1适合慢病毒包装的HEK293T贴壁细胞的克隆筛选，筛选出侵染效率较高的前若干个克隆细胞，进行扩大培养并建库，S2对筛选的HEK293T贴壁细胞进行快速悬浮驯化，得到细胞活率93～98%，且细胞分散性较好、无明显聚集的悬浮驯化成功的HEK293T细胞；S3悬浮HEK293T高滴度慢病毒包装克隆细胞的筛选，筛选侵染效率高的病毒上清，所对应的克隆细胞即为慢病毒高产的悬浮HEK293T细胞克隆。本发明提供的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，能快速获得生产高滴度慢病毒的悬浮HEK293T细胞克隆，所获得的悬浮HEK293T细胞克隆能无血清悬浮培养和病毒包装，病毒滴度高，纯化效率高，易于放大生产。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法。

背景技术

慢病毒常用于嵌合抗原受体-T细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T)，其具有转导效率高、可整合T细胞基因组并持续表达目标蛋白等优势。现如今，CAR-T生产大多基于慢病毒载体介导的CAR基因转移。当前，用于生产慢病毒的工艺大多基于依赖胎牛血清(FBS)的贴壁细胞工艺（如HEK293T），其具有慢病毒表达滴度高、硬件投入少等优点。然而，其依赖胎牛血清(FBS)，这与当前的法规不相适宜，因此必须对FBS的生产厂商进行严格审计，此外还需对去除进行评估和检测。其次，胎牛血清(FBS)批次及产地差异也可能导致所表达的慢病毒存在批间差异。另一个关键问题是，目前使用贴壁细胞工艺多数为细胞工厂，因此较难进行放大生产。目前，基于细胞工厂的慢病毒生产通常为10层细胞工厂（CF-10）或40层细胞工厂（CF-40），一般10～20个，这对于操作和人力提出了较大挑战。

悬浮细胞可以在不依赖于胎牛血清(FBS)的化学成分明确的培养基(CD media)中高密度生长，利用细胞培养摇瓶可很方便放大至生物反应器中（如2 L、15 L、50L、200 L、2000L）进行生产，因此易于放大生产。

当前，适用于慢病毒生产的商业化悬浮细胞系统为ThermoFisher公司的LV-MAX系统，其病毒包装滴度高，但其培养基和转染试剂包昂贵，且包装的慢病毒上清HCP(通常达200 μg/mL)和HCD(通常达20 μg/mL)含量高，给后续的纯化造成极大挑战。

现有技术中公开了部分HEK293T贴壁细胞的悬浮驯化工艺，这种悬浮驯化工艺是采用逐渐降低培养基中的胎牛血清(FBS)用量的方案，使HEK293T贴壁细胞逐渐驯化为不需要胎牛血清(FBS)的培养基的悬浮驯化方案，这种方案的缺点在于耗时很长，通常驯化时间至少需要一个月，且得到的驯化的悬浮HEK293T细胞经过质粒包装后的慢病毒滴度较低，而且其中HCP含量较高，使后续的纯化过程难度很大。

发明内容

本发明的目的在于针对背景技术中所述的现有的HEK293T贴壁细胞存在的依赖胎牛血清(FBS)，慢病毒存在批间差异，难以放大生产以及悬浮驯化细胞系统存在的培养基和转染试剂包昂贵，驯化时间长，通常至少要一个月，且包装的慢病毒上清HCP和HCD含量很高，给后续的纯化造成极大的困难等问题，提供一种能够解决前述问题的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，包括以下步骤：

S1、适合慢病毒包装的HEK293T贴壁细胞的克隆筛选，其具体包括以下步骤：

A1、复苏贴壁培养的HEK293T细胞，使用DEME培养基+10%FBS进行贴壁培养；

A2、将对数生长期的细胞以VP-SFM培养基+2mMGLutaMax+10%FBS完全培养基进行贴壁培养；