[发明专利]基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法

权利要求书

1.一种基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、适合慢病毒包装的HEK293T贴壁细胞的克隆筛选，其具体包括以下步骤：

A1、复苏贴壁培养的HEK293T细胞，使用DEME培养基+10%FBS进行贴壁培养；

A2、将对数生长期的细胞以VP-SFM培养基+2mMGLutaMax+10%FBS完全培养基进行贴壁培养；

A3、将对数生长期的细胞进行96孔细胞培养板铺板，每孔补加VP-SFM培养基+2mMGLutaMax+10%FBS完全培养基；

A4、培养5～7天后进行克隆观察，并更换一部分的VP-SFM培养基+2mMGLutaMax+10%FBS完全培养基，继续培养，待细胞克隆扩大至所需的量时使用胰酶进行消化，将一部分细胞作为种子细胞，另一部分细胞进行携带EGFP基因的慢病毒转移质粒和包装质粒共转染，并进行细胞克隆标记；筛选出侵染效率较高的前若干个克隆细胞，进行扩大培养并建库，扩大培养时使用的培养基为VP-SFM+1%FBS培养基；

S2、对筛选的HEK293T贴壁细胞进行快速悬浮驯化，具体包括以下步骤：

B1、使用VP-SFM+2 mM GlutaMax+1%FBS培养基复苏冻存的EGFP慢病毒包装滴度高的克隆细胞，静置培养2～3天后消耗细胞；然后仅以VP-SFM+2 mM GlutaMax进行扩大静置培养，继续静置培养2～3天后收集细胞；

用VP-SFM +1%FBS完全培养基培养至状态良好后，使用不含FBS的VP-SFM培养基进行扩大培养，收集扩大培养的细胞进行活细胞密度计数；

B2、使用Transpro CD01+4 mM GlutaMax+0.1% Anti-clumping agent完全培养基于细胞培养摇瓶进行振荡培养，复悬细胞后使用细胞培养摇床进行振荡培养，然后进行适应性传代培养，直至细胞活率为93～98%，且细胞分散性较好、无明显聚集，此即为悬浮驯化成功的HEK293T细胞，将若干悬浮驯化好的克隆细胞扩大培养并进行冻存；

S3、悬浮HEK293T高滴度慢病毒包装克隆细胞的筛选，具体步骤为：使用Transpro CD01+4 mM GlutaMax+0.1% Anti-clumping agent完全培养基复苏冻存的HEK293T悬浮细胞克隆，使用EGFP慢病毒转移质粒和包装质粒共转染各悬浮HEK293T细胞克隆，48 h后收获各细胞克隆含EGFP慢病毒的上清液，1500 g离心15 min去除细胞及其碎片，然后以此上清进行不同倍数稀释，并将稀释的病毒液侵染96孔板贴壁的HEK293T细胞，以荧光显微镜和流式细胞术(FACS)检测并筛选侵染效率高的病毒上清，所对应的克隆细胞即为慢病毒高产的悬浮HEK293T细胞克隆。

2.根据权利要求1所述的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，其特征在于：步骤A3中，采用有限稀释法按5-20 cells/mL进行96孔细胞培养板铺板，每孔添加50-100 μL稀释的细胞液，然后每孔补加50-100μL的VP-SFM培养基+2mMGLutaMax+10%FBS完全培养基。

3.根据权利要求1所述的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，其特征在于：步骤A4中，待细胞克隆扩大至96孔底的2/3时使用胰酶进行消化，将一部分细胞在新的96孔培养板继续培养作为种子细胞，另一部分细胞于另一个新的96孔板进行携带EGFP基因的慢病毒转移质粒转染，并进行细胞克隆标记；在进行转染时，培养24 h后进行EGFP慢病毒转移质粒转染，48 h后使用荧光显微镜进行绿色荧光观察，将绿色荧光发光点亮度高的前若干个克隆细胞进行扩大培养，扩大培养过程中进行细胞冻存备份；然后将扩大培养的克隆细胞进行24孔细胞培养板铺板，培养24 h后使用慢病毒包装质粒进行EGFP慢病毒包装，继续培养48 h后，收集携带EGFP的慢病毒上清液，并按不同稀释倍数侵染铺板的HEK293T细胞， 48～72 h后收集侵染的HEK293T细胞，使用荧光显微镜和FACS进行侵染效率检测，从而确定侵染效率较高的前若干个克隆细胞，进行扩大培养并建库，培养基为VP-SFM培养基+10%FBS完全培养基，待细胞状态良好后，使用VP-SFM +1%FBS完全培养基进行适应性培养，从而为悬浮驯化做准备。