[发明专利]CAMTA2基因缺失型斑马鱼的构建方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及CAMTA2基因缺失型斑马鱼的构建方法。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的CAMTA2基因上设计合适的打靶位点，从而提高了基因编辑的效率，降低了脱靶效应。构建获得的斑马鱼模型中CAMTA2基因表达发生改变，心脏发育受到影响。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及CAMTA2基因缺失型斑马鱼的构建方法。

背景技术

右心室肥厚导致的右心衰竭仍然是先天性心脏病患儿发病率和死亡率的主要原因。先天性肺动脉高压、法洛氏四联症和大动脉转位(解剖右室为功能左室)是造成该人群右心室肥厚的主要原因。从右室肥厚到右心室衰竭的转变经历了一个重构阶段，其特征是心肌细胞的结构和功能变化，这是右室特有的。在整个重构过程中，代谢向有氧糖酵解转变，线粒体功能障碍导致能量供应不足，而兴奋-收缩耦合损伤和异常胶原沉积分别导致收缩功能障碍和纤维化。转录因子(如HIF1α、FOXO1、cMyc)激活的改变和活性氧产生过度均介导了最终导致右心衰竭的心室重构。分子生物学技术的最新进展表明，在右心室重构过程中出现了诸如基因、miRNAs和血浆蛋白等生物标志物的失调。

哺乳动物基因组中有两个CAMTA基因，分别为CAMTA1和CAMTA2，这两个基因优先表达于心脏和大脑。其中，CAMTA1在胚胎心脏中强烈表达，而，CAMTA2在胚胎心脏中的表达水平远低于出生后心脏。研究表明，CAMTA2在体外和转基因小鼠心肌细胞中的过度表达导致心肌肥大。并且，CAMTA2突变小鼠没有明显的心脏表型，当这些小鼠受到各种肥厚应激时(包括主动脉紧束、血管紧张素Ⅱ慢性输注等方式)，它们的肥厚反应能力严重受损，说明CAMTA2基因的敲除导致小鼠对多种引起心肌肥厚刺激的反应减弱。Song K等人得出结论，CAMTA2不仅足以诱导心肌肥厚，而且对体内不同刺激产生最大的肥厚反应是必要的。另有研究表明，CAMTA2在心肌肥厚信号通路中的作用：CAMTA2在细胞质和细胞核之间循环，刺激Nkx2-5和其他尚未确定的转录因子的活性。CAMTA2被Ⅱ类HDACs抑制。PKC/PKD信号的激活导致Ⅱ类HDACs的磷酸化，从而为14-3-3蛋白质及其核出口建立了对接点，解除了对CAMTA2的抑制，从而促进心脏生长。

目前，CAMTA2在心肌肥大发生发展中的作用尚未完全探明。CAMTA2功能域包括CG-1，TAD，TIG，ANK等。CG-1结构域是CAMTA2与Nkx2-5结合所必需的，是NKx2-5依赖性启动子转录激活所必需的，也是诱导心脏生长所必需的，包含核出口序列。TIG结构域是刺激ANF启动子所必需的，但可与TAD(transcription activation domain，转录激活域)分离，其作用为稳定CAMTA2与nkx2-5结合的作用。CAMTA2的锚定蛋白重复区与Ⅱ类HDACs相结合，并负性调节TAD的活性。camta2的转录活性需要CG-1、TAD和TIG域与c端NLS的结合活性。而ANK结构域与HDAC相互作用可抑制CAMTA2的转录活性。这种相互作用的结构决定因素可能类似于那些介导Ⅱ类HDACs与其它包含转录激活因子的锚定蛋白重复区的联系的决定因素。而CAMTA2在心肌肥大发生发展过程中的更多作用机制，仍待进一步研究。

斑马鱼与人类心脏发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且CAMTA2基因进化上较为保守，研究发现CAMTA2在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼具有个体小、易于饲养、发育快、繁殖能力强、体外受精、胚胎体外发育且透明等优点。因此，构建CAMTA2基因缺失斑马鱼的模型，对CAMTA2基因功能以及作用机制的研究存在重要意义。