[发明专利]基于基因捕获技术的测序方法

说明书

本发明提供了一种基于基因捕获技术的测序方法，原理是使用重组酶复合物在37℃条件下协助3’端封闭的单链DNA探针高效特异性地杂交到双链目标DNA分子中，再利用单链DNA探针上带有的亲和标记对靶DNA进行特异性富集。这种方法既具有探针杂交捕获技术的长探针配对较强和探针设计要求低等优势，又具有CRISPR/dCas9系统操作简单、耗时短、DNA无需热变性、捕获效率高和成本低等优点，且探针不参与后续的扩增，提高鉴定准确性。因此相较于其他捕获技术，RATE‑seq具有操作简单、捕获效率高、耗时极短(30 min)、稳定性好和成本低等明显优势，非常适用于基因捕获和自动化应用。除此之外，RATE‑seq还能有效分离去除病理样本中的人类宿主DNA，提高病原微生物的检出率。

技术领域

本发明专利涉及一种基于基因捕获技术的测序方法，属于生物技术领域。

背景技术

二代和三代测序技术因具有通量大、信息全、操作简便等优势，成为基因诊断和治疗领域的核心技术。基因捕获一直是DNA和RNA高通量测序技术的一大难题。由于人的基因组信息庞大，大约包含30亿个碱基对，而真正编码基因的区域占比不到4%，外显子区域及转录调控元件区域占比低于1%。而致病突变绝大多数富集在外显子区域及转录调控元件区域上，因此这些区域的基因信息对疾病的诊断和治疗具有关键的作用。由于这些区域占比太少，利用全基因组测序技术进行序列信息验证和突变类型分析具有极低的效率和准确率。通常对于一个位点信息的判断需要成百乃至上万的测序覆盖深度，这意味着利用全基因测序进行基因信息的有效分析往往需要超过数百G的测序数据，这极大的增加了二代测序和三代测序在基因诊断上的成本和普及难度，也造成了大量的不必要浪费。因此，开发一种捕获靶位点基因序列的技术，是二代和三代测序技术在基因治疗领域普及和应用的关键。

目前已有的基因捕获技术主要分为两类。一类是探针杂交捕获技术，利用带修饰（如生物素）的长探针（40-120 nt）对基因组DNA进行杂交，并使用相应的亲和介质（如链霉亲和素磁珠）进行捕获。这种方法极其复杂，需要先将双链DNA进行预变性，再将变性成单链的DNA与探针进行杂交，杂交后的溶液进行真空干燥浓缩后，才能进行靶位点捕获。这种方法的优势是探针与靶DNA配对区域较长，结合能力强，且探针设计要求低。但也有明显的缺陷，如操作复杂、耗时长（约两天）、成本高、对仪器依赖性强、捕获效率较低、非特异性高、DNA损失大，极大地限制了捕获技术的应用。

近年来，随着基因编辑技术CRISPR/Cas系统的发展，各类Cas蛋白被开发出来应用于不同的领域。一种切割活性完全失活的dCas9成为体外基因捕获的重要工具。这种方法结合了CRISPR/Cas9基因编辑系统的高特异性，也利用了dCas9带有的解旋酶活性，因此可以在室温下利用带有特殊修饰的dCas9和sgRNA对靶位点进行捕获。这种捕获方法相较于传统的探针杂交捕获技术，具有成本低、耗时短（2h）、捕获效率高、操作简单、DNA无需热变性等优点，但是dCas9自身与DNA的非特异性结合和sgRNA的脱靶效应严重阻碍了捕获效率和特异性。此外，sgRNA的设计难度较大（依赖于PAM序列），与靶位点的配对长度较短（20 nt），严重阻碍了其在大规模基因捕获上的应用。且sgRNA和dCas9的稳定性较差也使得这种捕获方式难以大范围推广和普及。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于基因捕获技术的测序方法。

本发明采取的技术方案为：一种基于基因捕获技术的测序方法，其特征在于其步骤包括：

（1）获取样本的总DNA文库；

（2）针对待捕获的靶基因，设计并合成探针，所述探针与靶基因DNA严格互补配对，且设有便于与捕获介质结合的修饰，所述探针3’ 端采用双脱氧核糖核苷酸、生物素或者氨基修饰以封闭探针的3’ 端；

（3）探针与重组酶复合物预结合；

（4）探针-重组酶复合物与样本的总DNA文库结合；

（5）利用可与探针特异性结合的捕获介质，将与探针结合的靶基因DNA文库从总DNA文库中分离出来，获得富集的靶基因；