[发明专利]基于基因捕获技术的测序方法

权利要求书

1.一种基于基因捕获技术的测序方法，其特征在于其步骤包括：

（1）获取样本的总DNA文库；

（2）针对待捕获的靶基因，设计并合成探针，所述探针与靶基因DNA严格互补配对，且设有便于与捕获介质结合的修饰，所述探针3’ 端采用双脱氧核糖核苷酸、生物素或者氨基修饰；

（3）探针与重组酶复合物预结合；

（4）探针-重组酶复合物与样本的总DNA文库结合；

（5）利用可与探针特异性结合的捕获介质，将与探针结合的靶基因DNA文库从总DNA文库中分离出来，获得富集的靶基因；

（6）扩增获得的靶基因，测序。

2.根据权利要求1所述的基于基因捕获技术的测序方法，其特征在于：所述探针的长度为30-50 nt。

3.根据权利要求1所述的基于基因捕获技术的测序方法，其特征为：所述探针5’端采用生物素修饰或多聚脱氧腺苷酸修饰。

4.根据权利要求1所述的基于基因捕获技术的测序方法，其特征为：所述重组酶复合物包括UvsX重组酶和UvsY重组酶辅助蛋白，使用浓度在20-200 nM。

5.根据权利要求4所述的基于基因捕获技术的测序方法，其特征为：所述重组酶复合物还包括gp32单链DNA结合蛋白，使用浓度在10-50 nM。

6.根据权利要求1所述的基于基因捕获技术的测序方法，其特征为：所述探针的使用浓度10-100 nM，总DNA的投入量为0.1-100 ng/uL。

7.根据权利要求1所述的基于基因捕获技术的测序方法，其特征为：步骤（2）中使用预结合缓冲液，在室温下预结合5-30min，预结合缓冲液的配比为：10-100 mM 三羟甲基氨基甲烷，10-300 mM醋酸钾、3-50 mM醋酸镁、0.3-3 mM 二硫苏糖醇、1-20 mM 三磷酸腺苷。

8.根据权利要求1所述的基于基因捕获技术的测序方法，其特征为：步骤（3）中的结合温度为30-50℃。

9.根据权利要求3所述的基于基因捕获技术的测序方法，其特征为：当探针上的修饰是生物素修饰时，捕获介质使用链霉亲和素磁珠；当探针上的修饰是多聚脱氧腺苷酸修饰时，捕获介质使用多聚脱氧胸苷酸磁珠。

10.根据权利要求9所述的基于基因捕获技术的测序方法，其特征为：步骤（4）具体为：将捕获介质与反应体系在室温下孵育10-60min，分离捕获介质并清洗，然后将吸附在捕获介质上的DNA洗脱，洗脱的方式为高温98℃洗脱、1-20 mM生物素竞争洗脱或者体积浓度5%-50%变性剂去离子甲酰胺洗脱。

11.根据权利要求10所述的基于基因捕获技术的测序方法，其特征为：使用清洗缓冲液对捕获介质进行清洗，所述清洗缓冲液包含10-100 mM 三羟甲基氨基甲烷、10-2000 mM氯化钠、体积浓度0.1-3%的吐温20。