[发明专利]一种外周血NKT细胞培养液及培养方法

说明书

本发明公开了一种外周血NKT细胞培养液及培养方法，该NKT细胞培养方法包括步骤：将外周血单个核细胞加入含细胞因子的自体血清的淋巴细胞无血清培养基中培养14天左右；培养期间，每隔2~3天需要添加含细胞因子的培养液；培养结束后，经离心处理和0.9%的氯化钠溶液清洗，得到外周血NKT细胞；向外周血NKT细胞中加入人血清白蛋白后并用0.9%的氯化钠溶液定容，获得外周血NKT细胞。该培养方法，外周血单个核对自体血清无免疫排斥反应，细胞更纯，安全性更高；NKT细胞生长快、扩增倍率高；NKT细胞杀伤活性高，具有较强的肿瘤细胞杀伤作用。

技术领域

本发明涉及细胞学领域，尤其涉及一种外周血NKT细胞培养液及培养方法。

背景技术

NKT 细胞（natural killer T Cell），是一类由多种细胞因子诱导的杀伤细胞，是介导细胞毒活性最强的免疫细胞，兼具有T淋巴细胞的高度杀瘤活性和NK细胞非主要组织相兼容复合物（MHC）的限制性杀瘤效应。NKT 细胞其具有增殖速度快、杀瘤活性高等优点。

现阶段而言，NKT细胞培养是将分离的外周血血单个核细胞( PBMC )用IFN-γ处理24小时后，加入CD3单抗，IL-1α和IL-2因子进行刺激诱导，获得一定数量的NKT细胞，但最终获得的NKT细胞中有效细胞含量纯度低、细胞杀伤活性弱、且细胞扩增倍率相对不高。

发明内容

基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种高纯度、高扩增倍数的外周血NKT细胞培养液及培养方法。

本发明的技术方案一如下：

一种外周血NKT细胞培养液，包括含1~20v/v%自体血清的淋巴细胞无血清培养基，在该培养基中添加细胞因子：10~3000IU/ml的IL-2、5~500ng/ml 的IL-15、5~500ng/ml 的IL-18、5~1000ng/ml 的CD3 单克隆抗体、0.01~5ng/ml的达沙替尼及5~500IU/ml 的POM。

较好地，一实施例中，NKT细胞培养液包括含10v/v%自体血清的淋巴细胞无血清培养基，在该培养基中添加细胞因子：1000IU/ml的IL-2、50ng/ml 的IL-15、50ng/ml 的IL-18、200ng/ml 的CD3 单克隆抗体、2ng/ml的达沙替尼及100IU/ml 的POM。

本发明还提供一种外周血NKT细胞的培养方法，包括以下步骤：

S1、第0天，从外周血中分离出单个核细胞，将所述单个核细胞加入含1~20v/v%自体血清的淋巴细胞无血清培养基，并往该培养基中添加细胞因子，所述细胞因子包括浓度为10~3000IU/ml的IL-2、浓度为5~500ng/ml 的IL-15、浓度为5~500ng/ml 的IL-18、浓度为5~1000ng/ml 的CD3 单克隆抗体、浓度为0.01~5ng/ml的达沙替尼及浓度为5~500IU/ml 的POM；静置培养14天；

S2、第3和第5天，分别添加淋巴细胞无血清培养基及细胞因子，所述细胞因子包括浓度为10~3000IU/ml的IL-2、浓度为5~500ng/ml 的IL-15、浓度为5~500ng/ml 的IL-18、浓度为5~1000ng/ml 的CD3 单克隆抗体、浓度为0.01~5ng/ml的达沙替尼及浓度为5~500IU/ml 的POM；；

S3、第7天、第9天、第11天，分别添加淋巴细胞无血清培养基以及浓度为10~3000IU/ml的IL-2细胞因子；

S4、细胞培养结束后，将培养好的外周血NKT细胞转移到离心管中进行离心处理后，收集外周血NKT细胞并用0.9%的氯化钠溶液反复洗涤2~3次；

S5、往步骤S5的洗涤后获得的外周血NKT细胞中加入人血清白蛋白，并用0.9%的氯化钠溶液定容，得到所述外周血NKT细胞。