[发明专利]筛选自噬降解辅助蛋白的方法

说明书

本发明采用慢病毒构建过表达GFP‑LC3及MHC‑I‑His蛋白的胰腺癌细胞，在抑制自噬降解的条件下通过磁力分选技术分离自噬小体，镍柱分选技术分离自噬体中的MHC‑I‑His蛋白结合复合物，经过胰蛋白酶水解后，使用Nano‑LC‑Q‑TOF‑MS对纯化的水解肽段进行质谱分析，最后通过查找数据库确定分离出的蛋白种类，从而实现MHC‑I自噬降解辅助蛋白的筛选。本发明可准确筛选出MHC‑I自噬降解的辅助蛋白，为阻断MHC‑I自噬降解，提高机体抗肿瘤免疫研究提供新的靶点。

技术领域

本发明属于蛋白质研究技术领域，具体涉及一种筛选自噬降解辅助蛋白的方法。

背景技术

免疫逃逸是癌症免疫治疗中的一个主要障碍，常见的逃逸机制主要包括有：肿瘤抗原的封闭与表达下调导致的免疫识别障碍；低表达或缺失的主要组织相容性复合物I类(MHC-I)损伤肿瘤自身抗原呈递；肿瘤微环境抑制浸润免疫细胞抗癌活性等，其中MHC-I介导肿瘤抗原的呈递识别过程在抗肿瘤免疫反应中发挥着重要作用。肿瘤细胞通过MHC-I基因杂合性缺失、MHC-I蛋白自噬降解等途径下调自身MHC-I的表达水平，从而降低抗原被呈递的机率，减少肿瘤特异T细胞的识别和杀伤，最终实现自身免疫逃逸。

YAMAMOTO等人在《Nature》上揭示了胰腺癌细胞逃避免疫杀伤的机制与MHC-I的自噬降解有关。自噬是一种广泛存在于细胞体内的分解代谢途径，用来清除受损的细胞器或错误生成的蛋白，并释放代谢产物供细胞循环使用。自噬降解的过程大致如下：(1)细胞器或蛋白质与特定自噬受体结合为复合物，经脂质膜包裹形成囊泡即自噬小体；(2)自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体；(3)细胞器或蛋白质在自噬溶酶体中被各类水解酶降解。YAMAMOTO等研究人员发现在胰腺癌细胞中，细胞表面MHC-I分子表达很低，更多的存在于自噬小体和自噬溶酶体中。泛素化的MHC-I分子通过结合自噬相关受体NBR1，靶向到自噬小体中再经由自噬溶酶体降解。通过抑制自噬可以增加肿瘤细胞表面MHC-I分子的表达，增强抗原递呈，增加抗肿瘤免疫反应。研究明确了MHC-I自噬降解导致肿瘤免疫逃逸，削弱抗肿瘤免疫治疗，但MHC-I被自噬降解这一过程仍不是十分清楚。

发明内容

针对上述技术问题，本发明公开了一种筛选自噬降解辅助蛋白的方法，通过采用慢病毒构建过表达GFP-LC3及MHC-I-His蛋白的胰腺癌细胞，利用GFP标签与偶联抗GFP抗体磁珠的Co-IP特性分离自噬小体，再利用镍柱的AP特性进一步分离自噬小体中的MHC-I-蛋白复合物，最后利用质谱分析技术对蛋白复合物的水解肽段进行分析比对，最终实现MHC-I自噬降解辅助蛋白的精准筛选。

本发明提出一种筛选自噬降解辅助蛋白的方法，包括以下步骤：

S1构建含有外源基因的重组载体和病毒包装质粒转染癌细胞；

S2抑制自噬小体的降解及将所述自噬小体的分离，离心收集上清液，与偶联抗GFP抗体共孵育，筛选出GFP-LC3标记的所述自噬小体，进行形态学分析；

S3将所述自噬小体的双膜结构破坏，利用分选技术分离出带有His标签的MHC-I蛋白复合物；

S4利用酶消化所述MHC-I-蛋白复合物，纯化水解肽段并进行技术分析及鉴定。

具体地，所述S1中的外源基因为GFP-LC3和MHC-I-His。

具体地，所述S1中重组载体为慢病毒载体，所述癌细胞选自293T胰腺癌细胞。

具体地，所述S2中抑制剂为Baf-A1。

具体地，所述S2中抗GFP抗体设置为磁性微球，通过磁力分选系统以及磁选柱上筛选自噬小体。

具体地，所述S3中自噬小体使用0.1％十二烷基硫酸钠破坏双膜结构。

具体地，所述S3中自噬小体的蛋白质溶液的分离在镍柱上进行。