[发明专利]筛选自噬降解辅助蛋白的方法在审
| 申请号： | 202111250596.7 | 申请日： | 2021-10-26 |
| 公开（公告）号： | CN114196706A | 公开（公告）日： | 2022-03-18 |
| 发明（设计）人： | 夏厚军;唐秋菊 | 申请（专利权）人： | 深圳先进技术研究院;中国科学院深圳理工大学（筹） |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N5/10;C12N15/62;G01N33/68 |
| 代理公司： | 深圳五邻知识产权代理事务所(普通合伙) 44590 | 代理人： | 王策 |
| 地址： | 518055 广东省深圳市*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 筛选 降解 辅助 蛋白 方法 | ||
1.一种筛选自噬降解辅助蛋白的方法，所述筛选方法包括：
S1构建含有外源基因的重组载体和病毒包装质粒转染癌细胞；
S2抑制自噬小体的降解及将所述自噬小体的分离，离心收集上清液，与偶联抗GFP抗体共孵育，筛选出GFP-LC3标记的所述自噬小体，进行形态学分析；
S3将所述自噬小体的双膜结构破坏，利用分选技术分离出带有His标签的MHC-I蛋白复合物；
S4利用酶消化所述MHC-I-蛋白复合物，纯化水解肽段并进行技术分析及鉴定。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述S1中的外源基因为GFP-LC3和MHC-I-His。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述S1中重组载体为慢病毒载体，所述癌细胞选自293T胰腺癌细胞。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述S2中抑制剂为Baf-A1。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述S2中抗GFP抗体设置为磁性微球，通过磁力分选系统以及磁选柱上筛选自噬小体。
6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述S3中自噬小体使用0.1％十二烷基硫酸钠破坏双膜结构。
7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述S3中自噬小体的蛋白质溶液的分离在镍柱上进行。
8.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述S4中MHC-I-蛋白复合物采用胰蛋白酶消化，SPEC18柱纯化水解所述肽段。
9.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述S4中水解后的肽段采用Nano-LC-Q-TOF-MS技术分析。
10.一种筛选自噬降解辅助蛋白的系统，包括过表达GFP-LC3及MHC-I-His蛋白的胰腺癌细胞和抑制剂。
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