[发明专利]基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组、试剂盒、方法及应用

说明书

本发明提供了一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组、试剂盒、方法及应用，适用于体外快速检测MTHFR基因c.677CT多态性。方法包括以下步骤：(1)互补探针、荧光标记引物和通用下游引物的设计及合成；(2)获取待测样本的基因组DNA；(3)配制反应体系；(4)进行PCR反应；(5)基因型判定。本发明实现了在不需要双标荧光探针的前提下，仅一个反应即完成MTHFR基因c.677CT多态性检测的目的。

技术领域

本发明涉及一种检测MTHFR基因多态性的方法，具体涉及一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组、试剂盒、方法及应用。

背景技术

人亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolate reductases，MTHFR)基因编码的蛋白在5，10-亚甲基四氢叶酸还原成5-甲基四氢叶酸的过程起关键催化作用。MTHFR基因存在广泛的基因多态性，c.677CT是该基因在中国人群中最常见的单核苷酸多态性。c.677CT多态性会导致MTHFR酶活性的改变，通过对MTHFR基因的c.677CT多态性位点进行基因分型，可实现该酶活性的等效快速检测。

传统的单核苷酸多态性检测方法多为实验室常用技术，如DNA测序、限制性片段长度多态性及核酸杂交芯片等。尽管展现出很高的准确性，但缺陷依旧明显：其一，测序和芯片平台价格昂贵且操作程序复杂，需配备专业实验操作和分析人员，不适宜在基层医院或医学检验所开展；其二，属于“开管”检测，依赖于凝胶电泳平台，易产生假阳性的结果；其三，耗时较长，自取样到最终递呈检测报告，往往需要等待超过24小时，不适宜作为伴随检测技术；其四，不适合无创取样检测，如咽试纸取样仅能获得微量的DNA，多数情况下不能满足此类技术的“门槛”。

商品化的试剂盒多采用荧光定量-ARMS的方法检测MTHFR基因的c.677CT多态性。该技术操作简便，灵敏度高，但仍有明显的不足之处。其一，双标荧光探针合成难度大、成本高；其二，部分的荧光定量-ARMS技术使用传统的Taqman双标荧光探针，需要同时设置两个反应才能完成该多态性位点的检测，其检测通量受到限制；其三，使用MGB荧光探针可实现该多态性的单反应检测，但该类探针的合成原料受专利限制，成本高且获取难度大。此外，使用MGB荧光探针进行多态性检测通常无法克服信噪比低的缺陷。

发明内容

为了克服传统检测方法的不足之处，本发明提出一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组、试剂盒及方法，不仅大幅度降低了试剂成本，同时具有高通量和高特异性的特点，检测结果十分可靠。

为实现以上发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组，其特殊之处在于：针对MTHFR基因的c.677CT多态性位点设计，包括以下核苷酸序列的引物和探针：

通用下游引物：5’-GGGACGATGGGGCAAGTGATG-3’；

C荧光标记引物：

5’-荧光基团1-AGTGCTATCCGAGGGAAAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACC-3’

其中AGTGCTATCCGAGGGAA为互补探针结合序列；

AAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACC为基础引物序列；

T荧光标记引物：

5’-荧光基团2-AGTGCTATCCGAGGGAAAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACT-3’

其中AGTGCTATCCGAGGGAA为互补探针结合序列；

AAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACT为基础引物序列；