[发明专利]基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组、试剂盒、方法及应用

权利要求书

1.一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组，其特征在于：针对MTHFR基因的c.677CT多态性位点设计，包括以下核苷酸序列的引物和探针：

通用下游引物：5’-GGGACGATGGGGCAAGTGATG-3’；

C荧光标记引物：5’-荧光基团1-AGTGCTATCCGAGGGAAAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACC-3’

其中AGTGCTATCCGAGGGAA为互补探针结合序列；

AAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACC为基础引物序列；

T荧光标记引物：5’-荧光基团2-AGTGCTATCCGAGGGAAAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACT-3’

其中AGTGCTATCCGAGGGAA为互补探针结合序列；

AAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACT为基础引物序列；

互补探针：5’-TTCCCTCGGATAGCACT-猝灭基团-3’。

2.根据权利要求1所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组，其特征在于：所述C荧光标记引物中荧光基团1为FAM，HEX，ROX，TAMRA，Cy3或Cy5。

3.根据权利要求2所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组，其特征在于：所述T荧光标记引物中荧光基团2为FAM，HEX，ROX，TAMRA，Cy3或Cy5，且与荧光基团1不同。

4.根据权利要求3所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组，其特征在于：所述互补探针中猝灭基团为Dabcyl，Eclipse，BHQ1，BHQ2或BHQ3。

5.一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-4任一所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组。

6.根据权利要求5所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的试剂盒，其特征在于：还包括UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、DNA聚合酶，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脱氧尿苷三磷酸)以及PCR Buffer。

7.一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的方法，其特征在于：使用权利要求5或6所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的试剂盒，包括以下步骤：

步骤1、获取待测样本的基因组DNA；

步骤2、配制反应体系；

在同一反应管中加入待测样本的基因组DNA、通用下游引物、C荧光标记引物、T荧光标记引物、互补探针、UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、DNA聚合酶，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脱氧尿苷三磷酸)以及PCR Buffer；

步骤3、PCR反应；

将配制好的反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行反应；

步骤4、基因型判定；

PCR反应完成后进行待测样本MTHFR基因多态性的判定。

8.根据权利要求7所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的方法，其特征在于：步骤2中以单管反应体系20μL计，反应管中加入通用下游引物，250～550nM；C荧光标记引物，125～250nM；T荧光标记引物，125～250nM；互补探针，500～700nM；UNG酶，0.2～0.4U；DNA聚合酶，0.5～1U；dNTPs，各150～250μM；dUTP，400～500μM；10×PCR Buffer，2.0μL；基因组DNA，1-100ng，去离子水补足体积20μL。

9.根据权利要求8所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的方法，其特征在于，步骤3中PCR反应参数设置如下：50℃，3～5min；94～95℃，3～15min；94～95℃，5～25sec；60～62℃，15～30sec；50～53℃，15～30sec；35～40个循环；在50～53℃恒温过程中收集荧光。

10.权利要求1-4任一所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组在检测人MTHFR基因多态性中的应用。