[发明专利]一种检测ApoE单核苷酸多态性的方法

说明书

本发明公开了一种用于检测ApoE单核苷酸多态性的方法。所述方法包括将待检测标本的DNA模板进行PCR扩增，并对被荧光标记的扩增产物进行荧光信号的收集及结果判读，本发明还提供了用于上述方法的引物和探针组合。本发明提供的方法精准性高，稳定性好，快速，安全，易自动化操作。所述方法可在反复循环中通过信号的竞争性来完成对ApoE单核苷酸多态性的精准分型。

技术领域

本发明公开了一种基因多态性的检测方法，属于基因检测领域。

背景技术

人类载脂蛋白E(ApoE)是一种主要的胆固醇载体，在维持脂质平衡方面发挥重要作用。在外周，ApoE主要由肝脏和巨噬细胞合成。在大脑中，ApoE主要由星形胶质细胞产生，并通过低密度脂蛋白受体家族成员将胆固醇和其他必需脂质传递给神经元。三种亚型间的单个氨基酸差异改变了蛋白质结构，影响其脂质与受体结合，因此，ApoE以等形态依赖的方式调节胆固醇的同源性。

ApoE基因位于19号染色体，该染色体由4个外显子和3个内含子组成。ApoE基因在2个单核苷酸(rs429358和rs7412)上具有多态性，导致3个不同的等位基因(e2，e3和e4)和6个ApoE基因型(e2/e2，e2/e3，e2/e4，e3/e3，e3/e4和e4/e4)。e2，e3和e4等位基因的全球频率分别为8.4％，77.9％和13.7％。然而，ApoE等位基因的频率在不同种族人群中差异很大。三种亚型之间的差异存在于112氨基酸和158氨基酸，其中半胱氨酸或精氨酸存在：e2(cys112，cys158)，e3(cys112，arg 158)和e4(arg 112，arg 158)。尽管只有一个或两个氨基酸的差异，三种亚型之间的结构和功能上的差异能影响疾病风险。研究已经证实，ApoE的e4等位基因是迟发性阿尔茨海默病的遗传风险因素，与那些有e3/e3基因型的人相比，e4等位基因的1个拷贝(e2/e4,e3/e4)或2个拷贝(e4/e4)的个体患有的迟发性阿尔茨海默病风险增加。相反，与携带e3/e3基因型的人相比，携带e2/e2或e2/e3基因型的个体患尔茨海默病的风险会降低。

综上所述，通过对个体的ApoE基因进行检测，得到特定位点的基因型，可预测和有效的评估神经退行性疾病的风险，因此开发快速、经济有效、准确率高的ApoE单核苷酸多态性的检测方法至关重要。

目前对ApoE基因的检测，直接测序法和基因芯片杂交法比较常见。

直接测序法，是目前获得基因序列最准确的方法，是SNP位点分析的金标准，这种方法虽然可靠，但该检测方法受到测序仪器的限制，费用昂贵，推广困难。另外，直接测序对模板的数量要求高，通常需要通过PCR扩增然后进行胶回收目的片段后进行测序，操作复杂，周期长，且为开管操作，容易造成污染。

基因芯片杂交法，该技术方法是将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。通俗地说，就是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列。该检测方法，操作步骤烦琐，易出错，实验耗时4-8个小时，耗时较长。PCR结束后需开管操作，易造成污染的问题。此外，该检测方法用肉眼来对结果判读，准确性会受到影响，会出现假阳性、假阴性的结果判读。

本发明的目的就是提供一种灵敏度高、特异性强，操作简单，避免操作污染，保证操作安全的ApoE单核苷酸多态性的检测方法。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一种检测ApoE单核苷酸多态性的方法，所述方法包括以下步骤：