[发明专利]一种生产樱桃苷的重组酵母工程菌株及应用

说明书

本发明公开了一种生产樱桃苷的重组酵母工程菌株及应用，属于基因工程及生物工程技术领域。本发明通过表达葡萄糖基转移酶UGT73C6的重组酿酒酵母，获得了能够合成樱桃苷的重组酿酒酵母菌，并进一步强化了内源UDP‑葡萄糖生物合成途径，提高了UDP‑葡萄糖的供应量，构建并强化了异源蔗糖磷酸化酶途径和莽草酸途径，提高了樱桃苷的产量，使发酵120h的酿酒酵母樱桃苷产量达136.7mg/L，为后续的黄酮类化合物生物合成奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种生产樱桃苷的重组酵母工程菌株及应用，属于基因工程及生物工程技术领域。

背景技术

樱桃苷是一种糖基化黄酮类化合物，是柑橘类植物的重要成分，对人类健康具有重要的有益作用。樱桃苷具有抗病毒、抗炎、降血糖、降胆固醇等多种生物活性，在糖尿病治疗中具有巨大的应用潜力。樱桃苷是存在于葡萄柚中，可以从果皮和种子等废弃物中提取出来。其水解产物柚皮素在药物、化妆品和食品工业领域具有巨大的应用潜力。

目前工业上生产黄酮类化合物的主要方法是植物提取，但高附加值黄酮类化合物樱桃苷在植物组织中积累水平很低，利用传统提取工艺分离纯化费时、昂贵、浪费自然资源，过程中使用大量有机溶剂对环境造成威胁。此外，植物的生长受到季节、环境(如土壤成分、营养)和生长周期等因素的影响。采用化学合成可能提供了一种替代方法，但受所需产品复杂化学结构的限制，难以工业化生产。因此，针对天然产物提取和化学合成樱桃苷在产品稳定性、产品质量安全和价格优势等方面的局限，近年快速发展起来的代谢工程与合成生物学可为黄酮类化合物的合成提供思路。

发明内容

本发明通过敲除酿酒酵母自身的葡萄糖苷水解酶(EXG1和SPR1)，并在表达了来源于拟南芥的葡萄糖基转移酶基因UGT73C6，实现了樱桃苷的合成。随后，通过强化内源UDP-葡萄糖生物合成途径基因PGM1、UGP1、URA6和YNK1的表达，增加了UDP-葡萄糖的供应。再通过引入来源于大肠杆菌的异源蔗糖磷酸化酶途径基因galU和过量表达莽草酸途径基因ARO1、ARO2、ARO3和来源于大肠杆菌的aroL，进一步提高了樱桃苷的产量，得到了高产樱桃苷的酿酒酵母菌株。

本发明提供了编码葡萄糖基转移酶的基因UGT73C6，其含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一株可合成樱桃苷的酿酒酵母工程菌，以含有柚皮素合成途径的酿酒酵母为出发菌株，表达了来源于Arabidopsis thaliana的葡萄糖基转移酶基因UGT73C6。

在一种实施方式中，所述酿酒酵母还进行了如下至少一种改进：

(1)敲除了酿酒酵母内源糖苷水解酶基因EXG1和/或SPR1；

(2)过量表达酿酒酵母内源基因PGM1、UGP1、URA6和YNK1强化内源UDP-葡萄糖生物合成途径；

(3)引入了异源蔗糖磷酸化酶途径基因galU；

(4)过量表达莽草酸途径基因ARO1、ARO2、ARO3和aroL。

在一种实施方式中，所述基因UGT73C6的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述基因UGT73C6整合在位点EXG1处。

在一种实施方式中，利用启动子P_CCW12起始UGT73C6基因表达。

在一种实施方式中，所述葡萄糖生物合成途径基因PGM1序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述基因PGM1整合在GAL10位点处。

在一种实施方式中，用启动子P_TDH3起始PGM1基因的表达。