[发明专利]猪流行性腹泻病毒N基因的RT-RAA荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及猪流行性腹泻病毒N基因的RT‑RAA荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法。本发明所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的引物对可以特异性扩增猪流行性腹泻病毒N基因，利用该引物对可以检测猪流行性腹泻病毒，且检测周期更短、特异性强。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及猪流行性腹泻病毒N基因的RT-RAA荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)是目前在全球范围内广泛流行的冠状病毒，PEDV为囊膜病毒，属于冠状病毒科(Coronaviridae)、α冠状病毒属(alphacoronavirus)成员，主要侵害各日龄猪，尤其可感染仔猪小肠，并迅速导致仔猪产生水样腹泻，伴随呕吐、脱水等临床症状，致死率高达100％。

最新研究数据表明，我国的PEDV流行株中的S1基因正在发生变异，变异株的感染导致猪流行性腹泻病的严重程度，随着PEDV变异株的流行，疫苗毒株也急需进行替换。由于检测是防控PEDV的另一种有效方式之一，因此，针对PEDV的优势检测方法势在必行。

目前，已建立PEDV诊断方法有病毒分离和RT-PCR等。PEDV比较难分离，必须添加适量胰酶才有可能分离到病毒，敏感度不高，且操作繁琐，周期较长；常规RT-PCR检测方法虽简单、方便、快速，但仍存在检测周期长、假阳性和PCR污染的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了猪流行性腹泻病毒N基因的RT-RAA(重组酶介导链替换核酸扩增法)荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法。本发明提供的引物对可以特异性扩增猪流行性腹泻病毒N基因，利用该引物对可以检测猪流行性腹泻病毒，且检测周期更短、特异性更强。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒N基因的RT-RAA荧光法检测引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了上述引物对在制备检测猪流行性腹泻病毒的试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物对。

优选的，所述试剂盒还包括针对猪流行性腹泻病毒N基因设计的探针。

优选的，所述探针包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针。

优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；

所述阳性对照品包括含有猪流行性腹泻病毒AJ1102的核酸；所述阴性对照品包括ddH₂O。

优选的，所述阳性对照品的扩增碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种非诊断目的的检测猪流行性腹泻病毒的方法，包括如下步骤：

提取待测样本的RNA，以待测样本的RNA为模板，利用上述的试剂盒进行RT-RAA反应；

结果判定：若出峰时间≤19.5min或Ct值≤39，则待测样本为猪流行性腹泻病毒阳性；若出峰时间＞19.5min或Ct值＞39，则待测样本为猪流行性腹泻病毒阴性。

优选的，所述RT-RAA的反应温度为41℃，反应时间为20～30min。

优选的，所述试剂盒中的引物对的正向引物和反向引物的工作浓度均为10μmol/L；所述试剂盒中的探针的工作浓度为10μmol/L。