[发明专利]一种分子检测方法

说明书

本发明涉及分子检测领域，具体涉及一种分子检测方法，首先，在载有用于检测的核糖核酸（RNA）探针微阵列的基因芯片上，使用具有链置换活性的DNA聚合酶、扩增引物等对检测分子进行恒温扩增获得单链DNA扩增产物。若检测分子中含有阳性序列，则单链DNA扩增产物会与基因芯片上的互补核糖核酸探针杂交。随后，反应混合液中的RNase H会特异性分解与单链DNA扩增产物杂交的核糖核酸探针。最后，通过检测基因芯片上的探针分解状况即可完成检测分析。本发明具有检测灵敏度高﹑疾病诊断特异性高﹑检测效率高﹑检测便利性高和检测成本低等优势。

技术领域

本发明涉及分子检测领域，具体涉及一种分子检测方法。

背景技术

分子检测是通过应用分子生物学方法，检测受检个体或其携带病毒、病原体的遗传物质的结构或表达水平的变化，进而做出诊断结果的技术。其检测对象主要为核酸（DNA和RNA）。分子检测是临床医学检测领域中的重要组成部分，被广泛应用于传染性疾病、优生优育、血液筛查、遗传性疾病、肿瘤伴随诊断等领域。

基于核酸扩增技术的分子检测技术被广泛地应用于科研领域和临床医学领域中的核酸检测分析。核酸扩增技术主要是采用酶催化反应进行的。例如，在聚合酶链式反应（PCR）中，利用DNA在95 °C高温时会变性成单链，低温（通常是60 °C左右）时引物与单链DNA依据碱基互补配对的原则结合，再将温度调至DNA聚合酶最适反应温度（通常是72 °C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。通过PCR反应扩增出高的拷贝数，然后通过荧光探针或荧光素染色等凝胶电泳方法即可实现检测分析。但是，PCR方法需要在高温和低温中重复循环数十次才可实现检测分析，需要使用能够随时间严格调节宽范围温度的昂贵的热循环仪和昂贵的荧光检测光学系统，从而导致PCR检测效率低，便利性差和使用成本高等缺点。

为了解决检测效率低，便利性差和使用成本高等问题，许多科研机构和科技公司开发了可以在恒温条件下进行的核酸扩增方法。例如链替代扩增反应（Stranddisplacement amplification method，专利文件：JPH07114718）﹑滚环扩增（Rollingcircle amplification，专利文件：WO1997019193，EP1585833）﹑环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，专利文件：US6410278）﹑核酸依赖性扩增（Nuclearacid sequence-based amplification，专利文件：EP0329822）﹑转录介导扩增（Transcription Mediated Amplification，专利文件：US5399491和US5824518）等等。然而上述恒温扩增的方法虽然在一定程度上提高了检测的效率和便利性﹑降低了检测的成本，但是在检测灵敏度方面具有一定的问题。

在多数传染病中，例如呼吸道传染病中，许多病毒和细菌引发的呼吸道感染的症状相似，以非典型肺炎为例，肺炎支原体﹑肺炎衣原体﹑肺炎军团菌﹑百日咳博德特氏菌﹑副百日咳博德特氏菌﹑流感嗜血杆菌﹑肺炎链球菌﹑立克次体、腺病毒以及SARS等均有可能引发非典型肺炎。因此，如何特异性地诊断病原体对患者救治具有重大意义。然而，上述PCR和恒温扩增检测方法，受限于其荧光检测通道的数目，往往要求多种病原体或致病基因探针使用同种荧光素进行标识，从而导致检测结果无法明确至特定的病原体或致病基因。因此，上述PCR和恒温扩增检测方法在疾病诊断特异性方面具有极大的限制。

基于基因芯片技术的分子检测技术在疾病诊断特异性方面具有不可替代的优势。基因芯片是指通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，即在一块基片表面固定了序列已知的靶标核苷酸探针，当溶液中带有标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定探针位置，即可获得一组序列完全互补的探针序列，从而实现对目标DNA或RNA的检测分析。