[发明专利]一种活细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度测定方法

说明书

本发明提供了一种活细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度测定方法，属于生物分析化学技术领域，解决了现有技术无法精准测定正常细胞线粒体中GSH浓度的问题。该方法包括如下步骤：分别制备包含9位N‑取代吗啉基团的派罗宁类衍生物的荧光探针以及与所述荧光探针适配的检测溶液；将所述荧光探针放入检测溶液中，获得含有荧光探针的检测溶液；将含有荧光探针的检测溶液加入待检测细胞培养液中，在CO₂培养箱中孵育预设时间；孵育完成后，用预设波长的光照射加入检测溶液后的待检测细胞培养液，监测两个不同发射通道的荧光发射强度，确定所述两个发射通道的荧光强度比率，得出待检测细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度。实现了检测精度可达10×10^‑9mol/L数量级。

技术领域

本发明涉及生物分析化学技术领域，尤其涉及一种活细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度测定方法。

背景技术

还原型谷胱甘肽(GSH)是一种重要的内源性生物还原剂，在维持细胞正常生理功能、氧化应激、铁死亡等过程中起着重要的调节作用。GSH在HeLa细胞、A549等多种癌细胞中具有较高的含量(0.5～10mM)，其浓度变化直接关系癌细胞的存活率。目前，已有多种荧光探针分子用于癌细胞中GSH含量的测定(X.Jiang,J.Chen,A.et al.Nat.Commun.,2017,8,16087.)。

现有技术并无正常细胞线粒体中GSH的测定方法。目前市售的GSH检测试剂盒只能测定生物组织检材中的GSH整体含量，由于精度较低，并不能对单细胞线粒体中GSH的含量进行检测。而且，正常细胞受外界刺激，如人肺上皮细胞受到PM2.5等超细颗粒物的作用，进而引起线粒体GSH的动态变化，是细胞正常或病理状态的重要表征。

因此，在医学、细胞生物学、化学生物学、毒理学等相关科学领域中，非常有必要建立一种简便、快速、实时检测活细胞存活状态下线粒体GSH浓度的测定方法。

发明内容

鉴于上述的分析，本发明实施例旨在提供一种活细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度测定方法，用以解决现有技术无法精准测定正常细胞线粒体中GSH浓度的问题。

一方面，本发明实施例提供了一种活细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度测定方法，包括如下步骤：

分别制备包含9位N-取代吗啉基团的派罗宁类衍生物的荧光探针以及与所述荧光探针适配的检测溶液；

将所述荧光探针放入检测溶液中，获得含有荧光探针的检测溶液；

将所述含有荧光探针的检测溶液加入待检测细胞培养液中，在CO₂培养箱中孵育预设时间；

孵育完成后，用预设波长的光照射加入检测溶液后的待检测细胞培养液，监测两个不同发射通道的荧光发射强度，确定所述两个发射通道的荧光强度比率，得出待检测细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度。

上述技术方案的有益效果如下：公开了一种基于比率荧光法测定活细胞线粒体中GSH浓度的测定方法，具有较好的活细胞线粒体定位功能，可以在(0.01～50.0)×10^-6mol/L的浓度范围内检测活细胞线粒体GSH含量，简便、快速、实时测定活细胞线粒体内GSH浓度，并监测其变化动态。与目前市场上出售的比色型GSH试剂盒比较，上述技术方案的检测精度更高，并且，通过采用比率荧光法进行定量，避免了探针的浓度误差、光漂白和背景干扰等问题。另外，现有技术的线粒体GSH探针基本主要是对癌细胞的测量，本方法由于检测精度更高，可对正常活细胞线粒体中GSH浓度进行定量，广泛适用于如炎症、神经退行性疾病等非肿瘤类疾病的细胞研究，以及传统的基质、血清、血液、尿液、细胞和组织样本的GSH检测。

基于上述方法的进一步改进，所述9位N-取代吗啉基团的派罗宁类衍生物的分子式为