[发明专利]一种活细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度测定方法

权利要求书

1.一种活细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

分别制备包含9位N-取代吗啉基团的派罗宁类衍生物的荧光探针以及与所述荧光探针适配的检测溶液；

将所述荧光探针放入检测溶液中，获得含有荧光探针的检测溶液；

将所述含有荧光探针的检测溶液加入待检测细胞培养液中，在CO₂培养箱中孵育预设时间；

孵育完成后，用预设波长的光照射加入检测溶液后的待检测细胞培养液，监测两个不同发射通道的荧光发射强度，确定所述两个发射通道的荧光强度比率，得出待检测细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度。

2.根据权利要求1所述的活细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度测定方法，其特征在于，所述9位N-取代吗啉基团的派罗宁类衍生物的分子式为

其中，R₁、R₂、R₃、R₄独立地选自氢、取代或未取代脂肪烃基、取代或未取代脂环烃基、取代或未取代芳基、取代或未取代杂芳基中的一种，X为氧原子、偕二甲基或二甲硅基中的一种。

3.根据权利要求1或2所述的活细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度测定方法，其特征在于，通过如下方法制备包含9位N-取代吗啉基团的派罗宁类衍生物的荧光探针：

根据下面反应式一，从派罗宁衍生物经高锰酸钾KMnO₄氧化制备派罗宁氧酮；

根据下面反应式二，将制备的派罗宁氧酮在三氟磺酸酐Tf₂O(1)的作用下，与吗啉(2)反应，得到包含9位N-取代吗啉基团的派罗宁类衍生物的荧光探针

其中，R₁、R₂、R₃、R₄独立地选自氢、取代或未取代脂肪烃基、取代或未取代脂环烃基、取代或未取代芳基、取代或未取代杂芳基中的一种，X为氧原子、偕二甲基或二甲硅基中的一种。

4.根据权利要求3所述的活细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度测定方法，其特征在于，所述检测溶液为去氧的二次蒸馏水和二甲亚砜的混合溶液，或者去氧的二次蒸馏水、磷酸缓冲盐溶液、HEPES缓冲溶液与二甲亚砜的混合溶液。

5.根据权利要求4所述的活细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度测定方法，其特征在于，通过如下步骤获得与所述荧光探针适配的检测溶液：

制备去氧的二次蒸馏水；

将所述去氧的二次蒸馏水和二甲亚砜按预设比例进行混合，获得与所述荧光探针适配的检测溶液。

6.根据权利要求5所述的活细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度测定方法，其特征在于，所述预设比例为二次蒸馏水和液态二甲亚砜的容积比为99：1～999：1。

7.根据权利要求4或5所述的活细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度测定方法，其特征在于，将所述去氧的二次蒸馏水和二甲亚砜按预设比例进行混合后，还加入预设剂量的曲拉通X-100作为助剂，获得最终的与所述荧光探针适配的检测溶液。

8.根据权利要求4-6之一所述的活细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度测定方法，其特征在于，将所述去氧的二次蒸馏水和二甲亚砜按预设比例进行混合后，还加入预设剂量的维生素C作为稳定剂，获得最终的与所述荧光探针适配的检测溶液。

9.根据权利要求8所述的活细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度测定方法，其特征在于，孵育的预设时间为20～30min；并且，

获得与所述荧光探针适配的检测溶液后，将所述荧光探针放入检测溶液中，直到获得荧光探针浓度为1×10^-6mol/L的检测溶液，再对所述检测溶液进行除氧。

10.根据权利要求1-2、4-6、9之一所述的活细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度测定方法，其特征在于，确定所述两个发射通道的荧光强度比率后，通过如下步骤得出待检测细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度：

根据事先标定的荧光强度比率-还原型谷胱甘肽含量的标准曲线，确定该曲线上所述两个发射通道的荧光强度比率对应的还原型谷胱甘肽含量，作为待检测细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度；或者，

将所述两个发射通道的荧光强度比率输入事先训练好的深度学习网络中，获得待检测细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度。