[发明专利]U型接头及采用U型接头介导的磁珠偶联转座酶进行RNA快速均一化建库的方法

说明书

本发明公开了一种用于结合磁珠并偶联转座酶的U型接头，所述U形接头为：5’‑[Phos]CTGTCTCTTATACACATCTNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTT[Int NH2 C6 dT]TTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGATGTGTATAAGAGACAG‑3’、5’‑GTGACTGGAGTTC AGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNAGATGTGTATAAGAGACAG‑3’以及5’‑[Phos]‑CTGTCTCTTAT ACACAAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT‑3’三条寡核苷酸序列的退火产物，磁珠为羧基磁珠。并公开了采用U型接头介导的磁珠偶联转座酶进行RNA快速均一化建库的方法。本发明方法具有效率高、均一性好和产量高等显著的优点，非常适用于RNA自动化建库和低投入量RNA建库，也提供了应用于单细胞转录组测序的可能性。

技术领域

本发明涉及一种U型接头及采用U型接头介导的磁珠偶联转座酶进行RNA快速均一化建库的方法，属于生物技术领域。

背景技术

RNA二代测序技术(RNA Next-generation sequencing,RNA-seq)是一种高通量大规模的RNA并行测序技术，可以同时对几十万乃至几百万个RNA分子进行序列测定，用于未知病原的鉴定、生物遗传进化分析、基因表达差异分析和RNA合成及加工分析等。因此，RNA-seq广泛用于科学研究和疾病诊断等领域，并取得了许多突破性的结果。

RNA NGS文库构建是指通过逆转录和接头连接等过程将RNA转化为二代测序仪可识别的双链DNA的过程，是RNA-seq的关键步骤。传统的RNA建库方法操作繁琐，需要通过RNA片段化、逆转录、二链合成、磁珠回收、末端修复、接头连接、磁珠回收、文库扩增和磁珠回收等9个步骤才能完成RNA文库的构建，整个流程操作繁琐，RNA损失严重、耗时长(需要5个小时)，非常不适合自动化建库和低丰度RNA建库。此外，由于RNA中包含90％左右的核糖体RNA(rRNA)，因此在RNA建库前需要进行rRNA的去除。常规的RNaseH切割法和杂交捕获法去除rRNA需要近2个小时，大大地增加了RNA建库的难度和耗时。我们在之前开发了一种利用逆转录阻碍探针的快速核糖体RNA去除技术(专利号：ZL202110257924.X)，可以在RNA NGS建库过程中一步快速去除核糖体RNA，整个过程仅需2分钟，非常适用于快速自动化建库和病原RNA NGS诊断。

近期，有不少研究表明转座酶Tn5可以介导DNA和RNA杂交链的片段化(Di,L.,Fu,Y.,Sun,Y.,Li,J.,Wang,J..(2020).RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids.Proceedings of the National Academy of Sciences,117(6),201919800；Lu,B.,Dong,L.,Yi,D.,Zhang,M.,Yi,C..(2020).Transposase assisted tagmentationof RNA/DNA hybrid duplexes.eLife Sciences,9；202010111715.X；202010111715.X；202010958566.0)。这极大地缩短了RNA建库的时长，减少了RNA建库的操作。在RNA自动化建库和低投入量RNA(如单细胞RNA)建库过程中具有重要的应用前景和价值。但是，由于转座酶对RNA/DNA底物具有很低的片段化活性，因此在片段化效率和片段化产物分布上具有严重的偏好性和不均一性。