[发明专利]检测松材线虫的LAMP引物、检测方法及LAMP检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测松材线虫的LAMP引物、检测方法及LAMP检测试剂盒。本发明以Bx‑cpi基因作为松材线虫LAMP检测的靶标基因设计多对LAMP检测引物，通过大量的筛选试验最终筛选得到了特异性强、检测效率高的LAMP引物组。在此基础上，本发明提供了检测松材线虫的LAMP检测方法以及LAMP试剂盒。本发明提供的LAMP检测方法以及检测试剂盒具有操作简便、成本低、稳定性高、特异性强、检测效率高等优点，在松材线虫检测中具有应用前景。

技术领域

本发明涉及检测植物线虫的试剂盒，尤其涉及一种检测松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的LAMP检测引物、检测方法及LAMP检测试剂盒，属于松材线虫的检测领域。

背景技术

松材线虫病又称松树萎蔫病，是由松材线虫侵染引发的一种毁灭性松林病害。松材线虫Bursaphelenchus xylophilus(SteinerBuhrer)(Nickle WR,Golden AM,MamiyaY,et al.On the taxonomy and morphology of the pine wood nematode,Bursaphelenchus xylophilus(SteinerBuhrer1934) Nickle 1970.Journal ofNematology,1981,13:385-392.)属于线形动物门、滑刃目Aphelenchida、滑刃科Aphelenchoididae、伞滑刃属Bursaphelenchus。感染松材线虫的松树树脂分泌逐渐减少，针叶先是褪色和黄化，进而枯萎变成红褐色，最终全株死亡。松树在感染松材线虫后发病迅速，30-90天即可导致松树完全枯死，致死率极高，3-5年即可造成大面积林分死亡。因松材线虫致死的松树针叶不会脱落，大面积死亡的松林呈现出一片红褐色，如同正在肆虐的火灾持续蔓延，被称为“无烟的森林火灾”(于海英, 吴昊,张旭东等.落叶松自然条件下感染松材线虫初报.中国森林病虫, 2019,38(4):7-10；于海英,吴昊,黄瑞芬等.辽宁抚顺樟子松松材线虫分离与鉴定.中国森林病虫,2020,39(2):6-10.)。

松材线虫病自1982年传入中国以来，在中国快速传播扩散，目前已在全国19个省(区、市)，700多个县级行政区，约3000个乡镇发生松材线虫病疫情，累计造成超过9000万株松树死亡，年均直接经济损失数十亿元。特别是近年来，松材线虫病在中国发生形势发生重大变化，疫情向北扩散蔓延势头迅猛，疫情危害形势更加严峻，已入侵黄山、泰山、庐山、张家界、三峡库区、秦巴山区等多个国家级风景名胜区和重点生态区，对全国约9亿亩松树林木资源构成了严重威胁。

形态学是线虫种类常规鉴定的标准方法，松材线虫的鉴定主要依靠成虫的形态特征。但是通过形态学准确鉴定松材线虫成虫对于非专业人员相当困难，且无法对幼虫进行准确鉴定。由于形态学的限制，免疫学、生理生化和分子生物学方法被应用到松材线虫的鉴定上(王明旭.松材线虫分子生物学检测技术研究进展.湖南林业科技,2004,31(2):1-3；陈凤毛,叶建仁,吴小芹等.松材线虫SCAR标记与检测技术.林业科学,2012,48(3): 88-94.)。目前，松材线虫的检测与鉴定主要以分子生物学的方法为主。其中，DNA探针技术虽能有效地鉴定松材线虫，但费用较高，具有放射性；RAPD技术分析松材线虫与近似种的关系结果重复性较差；RFLP技术区分松材线虫和拟松材线虫，内切酶价格昂贵、耗时；荧光PCR灵敏、快速，但较昂贵；PCR技术操作简便、花费较少，但所需时间也较长。